Actividad antibacteriana de líneas celulares de hepatocitos y macrófagos frente a salmonella typhimurium. Efecto de citoquinas y agonistas de tlrs

Résumé

El ADN bacteriano es capaz de actuar como señal de alerta para los organismos superiores, de forma que estos puedan detectar la entrada de patógenos y desencadenar una respuesta eficaz frente a ellos. Ello es debido a la presencia de secuencias inmunoestimuladoras de ADN que se caracterizan por la presencia de un dinucleótido CpG no metilado, flanqueado por dos bases púricas en el extremo 5' y por dos bases pirimidínicas en su extremo 3'. Dichas secuencias son reconocidas y actúan a través de un receptor específico de superficie denominado Toll-Like Receptor 9 (TLR9). Estas secuencias inmunoestimuladoras carecen de efectos tóxicos letales, al tiempo que mantienen propiedades protectoras y terapéuticas. Por otra parte, la invasión microbiana de hepatocitos proporciona el lugar donde ciertos microorganismos intracelulares se acantonan y evaden las defensas. El propio hepatocito posee una capacidad de acción homeostática y efectora en procesos de tipo séptico, por cuanto son capaces de expresar acción antibacteriana y antiparasitaria. Objetivos del trabajo: Analizar los mecanismos de potenciación de la respuesta antibacteriana frente a Salmonella typhimurium en hepatocitos mediante la estimulación con diferentes activadores. Con este objetivo, hemos estimulado la línea de hepatocitos murinos (TIB-73) "in vitro" con oligonucleótidos CpG (CpG-ODN) y/o LPS y una mezcla de citoquinas (IL-1b e IFNg) más LPS y hemos cuantificado la supervivencia intracelular de Salmonella typhimurium en dichos hepatocitos infectados previamente con este agente microbiano. En este mismo modelo hemos analizado la expresión de diferentes genes que podrían estar implicados en la respuesta antibacteriana. El análisis se llevó a cabo mediante la obtención de ARNm de los hepatocitos estimulados y posterior amplificación de su cDNA por RT-PCR semicuantitativa. Se utilizaron los "primers" de los genes que codifican la Mn-superóxidodismutasa (Mn-SOD), la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), y el TLR9. Adicionalmente, hemos estudiado la expresión de TLR9 y TLR4 en la línea de hepatocitos murinos TIB-73 de manera comparativa con otra línea de células macrofágicas conocida como J774, mediante las técnicas de microscopía confocal y Western blot. Finalmente nos planteamos estudiar el papel que podrían desempeñar las MAP kinasas ERK 1/2 y p38 en la señalización intracelular inducida por la estimulación con oligonucleótidos con secuencias CpG y no-CpG y estructura de tipo fosfodiester o fosforotioato. Resultados: Los oligos inmunoestimuladores inducen una respuesta antibacteriana en los hepatocitos dependiente de la dosis utilizada, cuya intensidad es similar a la inducida por LPS y citoquinas. La estimulación de los hepatocitos con CpG-ODN, LPS y citoquinas induce un aumento en la producción de radicales reactivos de oxígeno (peróxidos intracelulares) que participan en la expresión de la actividad antimicrobiana detectada. La presencia de IL-6 revierte la generación de peróxidos intracelulares inducida por LPS y citoquinas. La estimulación de los hepatocitos con oligos inmunoestimuladores apenas induce la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa, mientras que los estímulos de LPS y citoquinas si la inducen. En concordancia con lo anterior, la generación de óxido nítrico tras la estimulación con ODNs es baja en comparación con la inducida por LPS y citoquinas. Esto revela diferencias en los mecanismos y vías de activación inducidos por la combinación de LPS y citoquinas, y CpG-ODN. Dependiendo del estímulo con el que se trataron los hepatocitos, existe variación en la expresión del gen que expresa TLR9. Por tanto, podemos concluir que los hepatocitos expresan el receptor TLR9 de reconocimiento de oligodeoxinucleótidos bacterianos y que tras su estimulación son capaces de generar un mecanismo productor de radicales libres de oxígeno y de inducir la expresión de la enzima Mn-SOD. Los hepatocitos TIB-73 expresan las proteínas TLR9 y TLR4. La estimulación con oligos CpG y no-CpG activa las vías de señalización mediadas por ERK 1/2 tanto en los hepatocitos TIB-73, como en los macrófagos J774. Como era de esperar, los ODN análogos de tipo fosforotioato con secuencias CpG y no-CpG inducen niveles mayores de fosforilación de ERK1/2 en células TIB-73, superiores incluso a las inducidas en células J774 bajo las mismas condiciones, y también un nivel menor de activación de p38. La fosforilación de ERK 1/2 inducida por oligodeoxinucleótidos sintéticos es dependiente de la dosis, y alcanza un nivel máximo a 100 ug/ml. El pretratamiento de los hepatocitos con un inhibidor de ERK 1/2 incrementó la fosforilación de p38. Discusión y Conclusiones: Los hepatocitos TIB-73 expresan de modo constitutivo TLR9 y TLR4 y responden a la estimulación con oligos sintéticos mediante una intensa fosforilación de ERK1/2 y una moderada fosforilación de p38, de una manera independiente de la existencia de motivos CpG. Cuando se bloquea ERK 1/2 por medio de un inhibidor específico, utilizan como vía alternativa la mediada por p38. Nuestros resultados demuestran que la respuesta de los hepatocitos TIB-73 a la estimulación con oligodeoxinucleótidos (generación de peróxidos intracelulares, nitritos y actividad antibacteriana) está mediada por las MAPKs ERK1/2 y p38. Por lo tanto, estos resultados indican que los hepatocitos son capaces no sólo de detectar la presencia de oligodeoxinucleótidos sintéticos, sino también de responder a los mismos. Esto apoya el posible papel de los hepatocitos como células que participan en la respuesta del sistema inmunitario natural o innato.