Análisis metabolómico y genómico de cultivos celulares de zanahoria

Resum

El objetivo principal de este trabajo de investigación fue caracterizar los metabolitos secundarios producidos en dos líneas celulares de zanahoria. Para ello, uno de los objetivos concretos fue la caracterización de la producción de compuestos de naturaleza isoprenoide y compuestos fenólicos en suspensiones celulares de una línea celular verde de Dacus carota en condiciones control y en condiciones de elicitación con ciclodextrinas, jasmonato de metilo, hexenol y beta-glucano separadamente o en combinación. De la misma manera, se caracterizó la producción de isoprenoides y compuestos fenólicos en suspensiones celulares de una línea celular naranja de D. carota en condiciones control y en condiciones de elicitación con ciclodextrinas y jasmonato de metilo. Asimismo, se estudio la producción de fitosteroles y carotenoides y la expresión de genes implicados en su ruta biosintética en suspensiones celulares de una línea celular naranja de D. carota en presencia de inhibidores de la ruta de biosíntesis de carotenoides y fitosteroles. Los resultados derivados de este estudio muestran que la línea celular de zanahoria verde biosintetizó de manera constitutiva los siguientes isoprenoides: carotenoides, alfa-tocoferol, clorofilas a y b y fitosteroles. El principal isoprenoide encontrado en la línea verde fue la luteína, una xantofila amarilla. La caracterización de la línea celular de zanahoria verde mostró que los fitoesteroles y compuestos fenólicos se acumularon principalmente en el medio extracelular (15100 microg/L y 477,5 microg/L, respectivamente) en presencia de ciclodextrinas. A diferencia de los compuestos mencionados anteriormente, el beta-caroteno (1138,1 microg/L), la luteína (25949,5 microg/L), el alfa-tocoferol (8063,8 microg/L) y la clorofila a (1625,1 microg/L) y b (9958,3 microg/L) se acumularon principalmente dentro de las células. Por lo tanto, los ciclodextrinas fueron capaces de inducir la ruta biosintética del mevalonato, aumentando la biosíntesis de fitoesteroles y compuestos fenólicos, y acumulándolos fuera de las células. Sin embargo, en ausencia de ciclodextrinas, las células de la zanahoria acumularon principalmente carotenoides a través de la ruta biosintética del 4-fosfato de metileritritol. Por lo tanto, el uso de ciclodextrinas permitiría la acumulación extracelular de fitoesteroles y compuestos fenólicos incrementando el flujo de carbono hacia la ruta citosólica del mevalonato y hacia la ruta de biosíntesis fenilpropanoide. Además, beta-glucano fue capaz de inducir la acumulación intracelular de alfa-tocoferol en la línea de células de zanahoria verde. Por otro lado, la línea celular de zanahoria naranja biosintetizó de manera constitutiva carotenoides y fitoesteroles. Los principales isoprenoides acumulados en esta línea celular fueron beta-caroteno y luteína. El análisis de esta línea naranja en condiciones de elicitación (50 mM ciclodextrinas) mostró que los fitoesteroles se acumulaban principalmente en el medio extracelular. Sin embargo, el beta-caroteno y la luteína se acumularon esencialmente dentro de las células. El tratamiento combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo mejoró la acumulación extracelular de compuestos fenólicos. Por lo tanto, la línea celular de zanahoria naranja bajo condición de elicitación proporciona un sistema biotecnológico eficiente para producir compuestos bioactivos. La adición de Terbinafina y Diflufenican que inhiben las rutas biosintéticas de fitoesteroles y carotenoides respectivamente, provocó una alta acumulación de escualeno y fitoeno. Estos compuestos bioactivos no suelen acumularse y, debido a esto, la línea celular de zanahoria naranja tratada con estos inhibidores es una fuente alternativa para producirlos. Los niveles de expresión más altos del gen escualeno sintasa se encontraron después de 24h de tratamiento con el inhibidor terbinafina. Esto puede explicar la alta acumulación intracelular de escualeno sin efecto negativo sobre los niveles de fitosteroles. Además, las ciclodextrinas no aumentaron los niveles de expresión de escualeno sintasa. Este hecho puso de manifiesto que los ciclodextrinas no funcionan como moléculas inductoras en la biosíntesis de los fitoesteroles, sino que son capaces de extraerlos de las membranas celulares. Por último, los niveles de expresión del gen fitoeno desaturasa 1 sugirieron que la acumulación del contenido total de carotenoides podría estar vinculada a la expresión de este gen. Sin embargo, el tratamiento con diflufenican disminuyó los niveles de expresión de fitoeno sintasa 1 y fitoeno desaturasa, lo que sugiere que la alta acumulación de fitoeno no se correlacionó con un alto nivel de expresión de estos genes.