Estudio epidemiológico de la linfadenitis caseosa en pequeños rumiantes en la región de alto alentejo (portugal) y valoración de técnicas moleculares y serológicas para el diagnóstico de la enfermedad

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis La Linfadenitis caseosa (LC) o pseudotuberculosis es una enfermedad piógena, causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, que afecta principalmente a pequeños rumiantes, si bien también se ha descrito en ciervos, vacas, caballos, cerdos y humanos. A pesar de su distribución mundial y su impacto económico en la producción ovina y caprina, su prevalencia real y distribución están subestimadas en aquellos países donde no se considera una enfermedad de declaración obligatoria. En Europa, hasta hace unos años, existía muy poco interés en la LC, si bien, en los últimos años se ha observado una preocupación creciente por parte de varios países debido al impacto económico que supone esta enfermedad en la industria ganadera de los pequeños rumiantes (Windsor, 2011; Smith, 2015). Aunque la enfermedad ha sido reportada en países anteriormente libres de la LC, probablemente debido a la importación de animales infectados, son muchas las regiones de Europa, como Portugal, en las que se desconoce la prevalencia, factores de riesgo e importancia económica de la Linfadenitis caseosa. La situación sanitaria de los rebaños de pequeños rumiantes en Portugal ha mejorado a lo largo de los años, con respecto a enfermedades animales sujetas a acciones oficiales de control o erradicación. Sin embargo, los esfuerzos de control de enfermedades no sometidas a declaración obligatoria, como la LC, son pequeños y se limitan a los realizados por organizaciones ganaderas y criadores de razas puras y autóctonas. En base a ello, en este trabajo de tesis doctoral se planteó una validación de una prueba ELISA comercial para la detección de animales portadores asintomáticos, a fin de aplicarla al estudio epidemiológico de la LC en la región del Alto Alentejo (Portugal) y, a largo plazo, en los programas nacionales de control y erradicación. La actual prevalencia de Linfadenitis caseosa en pequeños rumiantes esta subestimada, por el hecho de que no se trata de una enfermedad de notificación oficial en muchos países, como Portugal y España, y también porque los propietarios de las fincas no están informados de su impacto económico, no recurriendo a apoyo veterinario en los casos de los abscesos superficiales. Sin embargo, se trata de una enfermedad con importantes implicaciones no sólo económicas, sino también sanitarias. En los últimos 20 años ha habido un aumento de la inversión de las autoridades oficiales de los países desarrollados en programas de control y erradicación de la enfermedad, especialmente en países donde la producción de ganado ovino y caprino es importante para la economía del país. Estos programas deben basarse en el conocimiento de la prevalencia y los factores asociados a la aparición de la enfermedad, la aplicación de métodos de diagnóstico rápidos y fiables, y la implementación de medidas de lucha eficaces. La investigación desarrollada en este trabajo de Tesis aportará, por primera vez, información amplia y relevante sobre la epidemiología y el diagnóstico de la infección por C. pseudotuberculosis en el ganado ovino y caprino de Portugal. 2.contenido de la investigación El presente trabajo es el primer estudio de seroprevalencia realizado en el Alto Alentejo, principal región ganadera de Portugal, con el objetivo de (1) evaluar la validez y utilidad de diversas técnicas de diagnóstico serológico y molecular, (2) realizar una encuesta transversal de la seroprevalencia de C. pseudotuberculosis en los pequeños rumiantes, (3) realizar un estudio preliminar de los factores de riesgo asociados a la seropositividad y (4) describir los casos clínicos encontrados. Para ello, se tomaron muestras de suero a 756 animales procedentes de 82 explotaciones, así como muestras de abscesos y pus a 58 animales con lesiones piogranulomatosas cutáneas y viscerales. A fin de mejorar la sensibilidad de la PCR múltiple para la identificación de C. pseudotuberculosis a partir de muestras purulentas, previamente al estudio se determinó la validez de esta prueba tras incluir una dilución (1:10) de las muestras de ADN. Los resultados obtenidos no mostraron ninguna mejora en su validez diagnóstica, por lo que consideramos que la dilución sólo debería aplicarse en lesiones muy purulentas que resulten negativas al protocolo clásico. Por su parte, la comparación del test ELISA directo (ELITEST CLA # CK105A®) con la PCR múltiple (prueba de referencia) mostró una sensibilidad y especificidad diagnósticas del 100% y el 76,1%, respectivamente, con una Razón de Probabilidad de 4,78 para los resultados positivos y superior a 100 para los negativos. En base ello, el ELISA ofrecería una certeza del 100% al descartar la LC, independientemente de la probabilidad pre-prueba, pero la credibilidad de los resultados positivos sólo sería ≥ 80% cuando la prevalencia real en el colectivo fuese ≥ 46%. El estudio epidemiológico de la infección por C. pseudotuberculosis reflejó una seroprevalencia a nivel de granja (dispersión) del 75,4% (IC95% [66,4%-84,5%]), con un 16,7% de la cabaña ovina y caprina afectada (IC95% [14,1%-19,4%]), encontrando una susceptibilidad significativamente mayor en la especie caprina (RP 4,0 IC95% [3.31-4.84]), los animales de aptitud lechera (RP 2.91 IC95% [2.49, 3.42]) y aquellos criados en régimen de producción no extensivo (RP 4.19 IC95% [3.67, 4.79]) y/o en granjas de mediano y gran tamaño. Finalmente, el estudio patológico confirmó la importancia de la forma visceral, especialmente en la especie ovina. 3.conclusión Los resultados hallados en esta Tesis confirman la importancia sanitaria de la Linfadenitis caseosa en los pequeños rumiantes en Portugal, así como la utilidad de la técnica ELISA directa en la detección de casos subclínicos y como prueba de cribado en programas de lucha. Se presentan las siguientes conclusiones del trabajo realizado: 1. La dilución sistemática al 1:10 de las muestras de ADN obtenidas a partir de lesiones piogranulomatosas, propuesta en esta Tesis Doctoral con la finalidad de reducir la inhibición enzimática por detritus celulares, no aumentó la validez diagnóstica de la PCR múltiple, por lo que consideramos que sólo debería aplicarse en las lesiones con exceso de material purulento que resulten negativas al protocolo clásico, a fin de descartar falsos negativos. 2. La comparación del ELITEST CLA#CK105A® con la PCR múltiple mostró una sensibilidad y especificidad diagnósticas del 100% y el 76,1%, respectivamente, lo que confirma la validez de esta técnica para la detección de casos subclínicos y como herramienta de control en programas de saneamiento. 3. La validez del ELISA para los resultados positivos asegura, asimismo, que los animales positivos a la prueba en zonas con una prevalencia de Linfadenitis caseosa superior o igual al 46% tendrán la enfermedad con una certeza superior o igual al 80%. 4. Con una seroprevalencia a nivel de granja del 75,4% (IC95% [66,4%-84,5%]) y un 16,7% de la cabaña ovina y caprina afectada (IC95% [14,1%-19,4%]), este estudio confirma, por primera vez, el carácter endémico, la importancia sanitaria de la Linfadenitis caseosa en la región portuguesa de Alentejo y en Portugal, así como la necesidad de instaurar medidas rutinarias de control. 5. El estudio analítico de los factores de riesgo asociados a la seropositividad por C. pseudotuberculosis sugiere una mayor susceptibilidad de la especie caprina, los animales de aptitud lechera y aquellos criados en régimen de producción no extensivo y/o en granjas de mediano y gran tamaño. 6. El estudio patológico de los casos positivos confirmó la importancia de la forma visceral, especialmente en la especie ovina, siendo el pulmón el órgano más afectado por las lesiones piogranulomatosas típicas de esta enfermedad. 4. bibliografía  Abebe D & Tessema TS. (2015). Determination of Corynebacterium pseudotuberculosis prevalence and antimicrobial susceptibility pattern of isolates from lymph nodes of sheep and goats at an organic export abattoir, Modjo, Ethiopia. Letters in Applied Microbiology; 61:469-476. https://doi.org/10.1111/lam.12482.  Akgul G, Akgul MB, Ozen D, Demyrbylek SK. (2018). 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