Regeneración axonal de las células ganglionares de la retina de ratones albinos en injerto autólogo de nervio periférico

Resum

Introducción La población de células ganglionares de la retina (CGR) de roedores se ha utilizado frecuentemente para investigar las respuestas degenerativas y regenerativas de las neuronas del sistema nervioso central (SNC) en diferentes modelos experimentales de neuropatías, así como para ensayar las propiedades neuroprotectoras de distintas sustancias. En este trabajo hemos analizado cuantitativa y topográficamente la población total de CGRs en ratones adultos albinos que sobreviven a las cuatro semanas de la axotomía simple (sección intraorbitaria del nervio óptico) o de la axotomía e implante de nervio periférico (NP) autólogo anastomosado mediante la utilización de microsuturas o pegamento biológico (Tissucol). Además hemos investigado estas mismas cuestiones en la subpoblación de CGRs que median las respuestas fisiológicas visuales no formadoras de imágenes y tienen un pigmento visual (la melanopsina) que las hace intrínsecamente fotosensibles (ipCGRs). Objetivos Estudiar el efecto neuroprotector de los implantes de injertos autólogos de nervio periférico, y la respuesta regenerativa de las CGRs e ipCGRs del ratón albino adulto. Comparar la respuesta regenerativa cuando se utilizan dos métodos diferentes de anastomosis del injerto al muñón ocular del nervio óptico seccionado intraorbitariamente: microsuturas o pegamento biológico. Materiales y métodos En este trabajo se han utilizado ratones hembras adultas albinas (Swiss), que se dividieron en los siguientes grupos: i) sección intraorbitaria del nervio óptico (NO) izquierdo (axotomía simple); ii) implante de injerto de nervio periférico (NP) (nervio tibial derecho) mediante sutura en el muñón ocular del nervio óptico izquierdo seccionado, y;iii) implante de injerto de nervio periférico mediante pegamento biológico (nervio tibial derecho) en el muñón ocular del nervio óptico seccionado. En todos los casos el ojo experimental fue el izquierdo y el ojo derecho se usó como control. Las retinas se analizaron 28 días después de la cirugía. Para identificar la población CGRs que habían regenerado sus axones a lo largo del injerto de nervio periférico, tres días antes del procesado del animal se aplicó en el extremo distal del injerto el trazador neuronal fluorescente hidroxistilbamidina metanosulfonato (OHSt). Para identificar la población total de CGRs supervivientes se utilizaron técnicas de inmunohistofluorescencia que revelan la presencia de marcadores moleculares (anticuerpos anti- Brn3a y anti-melanopsina). Las poblaciones de CGRs así identificadas se analizaron cuantitativa y topográficamente con métodos modernos de análisis de imagen desarrollados recientemente. Todas las retinas se examinaron y fotografiaron en el microscopio de fluorescencia equipado con una platina motorizada controlada por un sistema de análisis de imagen: Image-Pro Plus® (IPP 5.1 para Windows®; Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Para hacer reconstrucciones de las retinas completas se capturaron imágenes individuales de forma secuencial y no solapada comprendiendo toda la superficie de la retina y posteriormente fueron unidas para formar el fotomontaje de la retina completa. Las imágenes digitales individuales, tanto de OHSt, como de Brn3a o melanopsina fueron procesadas por una serie de rutinas específicas para cada marcador, desarrolladas con el programa de análisis de imagen IPP para realizar el contaje automático. Los datos cuantitativos obtenidos de cada retina se utilizaron para generar los correspondientes mapas de vecinos o de isodensidad de las CGRs con los que se ilustra su distribución topográfica en la retina. Resultados Cuatro semanas después de la sección del nervio óptico, el número total medio de CGRs que sobreviven a la axotomía simple en las retinas experimentales (izquierdas) es de 5.818±1.405 (n=12) mientras que en las retinas control (derechas) es de 44.899±3.0265 (n=12). Estos resultados indican que aproximadamente un 13% de la población original de CGRs sobrevive a las cuatro semanas de la sección intraorbitaria del NO. Cuatro semanas después de la sección del nervio óptico, el número total medio de CGRs que sobreviven a la axotomía en las retinas experimentales (izquierdas) en las que se apuso un injerto de nervio periférico con Tissucol o microsuturas es de 9.716±3.452 (n=11) ó 8.575±3.763 (n=11), respectivamente, mientras que en sus retinas control (derechas) es de 45.084±4.440 (n=11) ó 47.975±3.407 (n=11), respectivamente, lo que supone un 22% o 18%, respectivamente, de la población original de CGR. Estos resultados indican que la aposición de un injerto de nervio periférico tiene un efecto neuroprotector sobre la supervivencia de las CGRs axotomizadas. El número total medio de CGRs marcadas retrógradamente con OHSt, que identifica las CGRs que han regenerado sus axones a lo largo de los injertos de nervio periférico, fue de 1.045±485 (n=8) cuando se utilizó pegamento biológico (Tissucol) y de 1.887±599 (n=12) cuando se utilizaron microsuturas, lo que supone una capacidad de regeneración axonal del 2,1% y 4%, respectivamente, de la población original de CGRs. En los mapas de distribución espacial (mapas de vecinos más próximos) se observó que las CGRs que habían sobrevivido a la axotomía y que habían regenerado en los injertos de nervio periférico se distribuyeron de forma uniforme y difusa por la totalidad de la retina, sin mostrar patrones geográficos sugerentes de daño isquémico o de una especial predisposición espacial para la supervivencia y/o regeneración axonal de las CGR. En relación con las ipCGRs, el número medio total en retinas control fue de 354±75 (n=2), de 168±62 (n=11) en el grupo de axotomía simple, de 110±21 (n=6) en el grupo de axotomía y Tissucol, y de 198±84 (n=3) en el grupo de la axotomía y sutura. Estos resultados indican que aproximadamente el 47% de las ipCGRs sobrevive a la axotomía simple y que la aposición de un injerto de NP (bien con microsuturas bien con Tissucol) no modifica esta supervivencia significativamente. Es decir, esta subpoblación de ipCGRs es más resistente a la axotomía, y su supervivencia no se influencia por la presencia de injertos de nervio periférico. Sin embargo, en estos grupos de ipCGRs no se observaron células marcadas retrógradamente con OHSt, lo que sugiere que esta subpoblación de ipCGRs no parece presentar capacidad de regeneración axonal. Conclusiones. En ratones adultos tipo Swiss la supervivencia de la población de CGRs a la sección del NO intraorbitario a las 4 semanas es de aproximadamente el 13%. Esta supervivencia se ve incrementada significativamente con el implante de un segmento autólogo de nervio periférico en el muñón ocular del NO seccionado, bien mediante la utilización de microsuturas ó de Tissucol. Las CGRs del ratón Swiss adulto son capaces de regenerar sus axones a lo largo de injertos autólogos de NP apuestos al muñón ocular del NO seccionado. Esta capacidad de regeneración se observa en un 2,1% de la población original de CGRs en el caso de la utilización de Tissucol y es significativamente superior (4%) en el caso de la utilización de microsuturas. La supervivencia a la axotomía de las CGRs intrínsecamente fotosensibles es significativamente superior a la del resto de la población de CGRs. Sin embargo esta población de ipCGRs carece de capacidad de regeneración axonal, y tampoco se ve influenciada (incrementada) su supervivencia con el implante de segmentos autólogos de nervio periférico. Se trata pues de una pequeña sub-población de CGRs que no parece responder a influencias extrínsecas (en cuanto a supervivencia y regeneración axonal se refiere) y sin embargo muestra una particular resistencia a la axotomía.