Aislamiento y caracterización de células madre de membrana anmiótica murina

Resumen

Introducción: Las células madre derivadas de membrana amniótica humana han demostrado poseer características importantes de proliferación, diferenciación multipotencial, inmunomodulación e immunotolerancia. Estas características, unidas al hecho de tratarse de un tejido desechable tras el parto, las convierte en un objeto interesante en medicina regenerativa. Objetivos: Aislar y caracterizar las células madre de membrana amniótica murina (MAm), estudiando para ello la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales, de pluripotencialidad y proliferación, y sus propiedades inmunomoduladoras. Estudiar su aplicación terapéutica en un modelo murino de hemofilia A severa. Metodología: Tras el aislamiento de la MAm a partir de ratones hembras gestantes C57BL/6, se llevó a cabo el estudio histológico y expresión de diversos marcadores de células madre en el tejido aislado mediante PCR e inmunofluorescencia. Seguidamente, se obtuvieron las diferentes poblaciones celulares de la MAm para el estudio de su cultivo realizando ensayos de proliferación, clonogenicidad, el análisis del ciclo celular y estudios de capacidad multipotencial e inmunomoduladora. Además, en los cultivos, se analizó la expresión de diversos marcadores mediante PCR, citometría e inmunofluorescencia. Las células derivadas de MAm fueron empleadas como terapia celular en un modelo murino de hemofilia A severa. Para ello, se realizó el trasplante celular por vía intraportal o intraperitoneal, sacrificando los animales desde 1 semana hasta 1 año tras el trasplante. Resultados: La MAm consta de una capa de células epiteliales y una subcapa de células mesenquimales estromales, con expresión de sus marcadores específicos, marcadores de pluripotencialidad y proliferación, además de factor VIII (FVIII) y factor von Willebrand de coagulación. Tras el aislamiento de las células, se obtuvieron dos tipos celulares: un cultivo de células de tipo epitelial y un cultivo de células CD44+. Las células de tipo epitelial mostraron tendencia a la senescencia en cultivo, expresión negativa para marcadores hematopoyéticos y positiva para marcadores de células madre epiteliales y de pluripotencialidad. Estas células también mostraron una expresión positiva de marcadores de células madre mesenquimales en algunos pases del cultivo, y fueron capaces de diferenciarse a células de la capa mesodérmica. Las células CD44+ mostraron una alta capacidad de proliferación, una capacidad multipotencial que se mantuvo en cultivo, y una expresión de marcadores de pluripotencialidad, de proliferación y de células madre mesenquimales como vimentina, CD90, CD105 y CD73. Además, presentaron capacidad clonogénica e importantes propiedades inmunomoduladoras, siendo capaces de inhibir la proliferación de linfocitos T de una manera dosis dependiente. Finalmente, el trasplante alogénico de MAm en los animales con hemofilia A dio lugar a la expresión positiva para FVIII en el tejido hepático de los animales trasplantados desde 1 semana hasta 12 meses tras el trasplante. Conclusiones: La MAm está formada por células madre epiteliales y mesenquimales con capacidad multipotencial y de proliferación en cultivo. Las dos poblaciones de MAm estudiadas en cultivo, presentaron características similares a las células madre epiteliales y mesenquimales respectivamente. Las células de la MAm sintetizaron FVIII y sobrevivieron hasta 12 meses tras su trasplante alogénico en el modelo de hemofilia A severa, pudiendo ser consideradas como una herramienta terapéutica para dicha enfermedad.