Aplicación experimental del anclaje en ortodoncia en base a bifosfonatos.

Resumen

APLICACIÓN EXPERIMENTAL DEL ANCLAJE EN ORTODONCIA EN BASE A BIFOSFONATOS RESUMEN TESIS DOCTORAL 1. ANTECEDENTES El movimiento dentario en ortodoncia es consecuencia de la aplicación de una fuerza mecánica controlada, que resulta en reabsorción por los osteoblastos, de la porción del hueso alveolar hacia dónde se desplaza el diente de modo ortodóncico (conocido como lado de presión) y de un proceso de oposición ósea en el lado opuesto (conocido como lado de tensión) mediado por las células osteoblásticas. Los bifosfonatos, análogos no hidrolizadles del pirofosfato, poseen una alta afinidad por el hueso mineral y una alta capacidad de inhibición de esta reabsorción ósea mediada por los osteoblastos. Aunque están claros los efectos adversos de los bbifosfonato, como reacción de fase aguda (RFA), efectos gastrointestinales, hipocalcemia, dolor óseo y muscular, efectos adversos oculares y renales chupando se encuentran en concentraciones plasmáticas elevadas e incluso osteonecrosis localizada a nivel de los huesos maxilares, sin embargo éstos varían en función del tipo, la dosis y el medio de administración del bifosfonato que se emplee. Uno de los problemas principales en el tratamiento ortodóncico es el movimiento indeseado de los dientes que actúan como unida des de anclaje así como la residida en los movimientos ortodóncico realizados a lo largo del tratamiento. A la vista de los estudios más recientes en este campo, se ha sugerido que la modulación de la actividad osteoclastogénica por los bifosfonatos pueda, variando dosis y ruta de administración, ser empleado en beneficio del tratamiento ortodóncico como vía de resolución o mejora de los problemas de anclaje y resididas dentarias.. En base a la literatura revisada y dada la capacidad de mostrada de inhibición osteoclástica por parte de los bifosfonatos cabe plantearse una serie de cuestiones secundarias. De este modo, siendo potentes inhibidotes o moduladotes de la osteoclastogénesis, ¿Será está capacidad descrita un factor único y suficiente para producir una inhibición del movimiento dentarlo subsiguiente temporal o permanente??, ¿en qué magnitud se producirá esa inhibición reabsortiva?, ¿En qué dosis se han de marcar los límites de toxicidad del bifosfonato a emplear? Una vez abordadas las cuestiones de carácter primario hemos de tener en cuenta lo siguiente, ¿La variación de la ruta y tipo de administración del compuesto repercutirá en una mejora de la eficacia para tal fin?. Igualmente es preciso plantearse ¿es posible la anulación del efecto tóxico o secundario del bifosfonato tras el cambio en el modo de administración del bifosfonato a través de un gel? 2. HIPÓTESIS DE TRABAJO Para dar respuesta a todo ello nos planteamos la s siguiente hipótesis de trabajo: ¿Si somos capacees de administrar bifosfonato en dosis bajas de forma tópica y con persistencia constante a través de un gel bioadhesivo, se producirá una inhibición del reclutamiento, actividad y supe vivencia de los osteoclastos, que conducirá a una disminución del número de estas células y a una supresión de la actividad de los mismos de modo temporal. Consecuentemente, cabría esperar una disminución del movimiento ortodóncico, meta primordial en la mejora de objetivos terapéuticos concretos como la providencia de anclaje y disminución de la recidiva en el tratamiento ortodóncico¿. 3. OBJETIVOS Se establecen los siguientes objetivos generales y específicos en nuestro proyecto de Investigación. 3.1. Objetivos generales Realizar una revisión sistemática de la literatura acerca de los bifosfonatos, su mecanismo de acción y efectos a largo plazo en el metabolismo óseo, e implicaciones en ella tratamiento de ortodoncia. -Recapitular y analizar de modo crítico los principales intentos de modulación biológica del movimiento dentario que han surgido a lo largo de la historia de la ortodoncia. -Determinar y analizar de modo crítico las dosis de bifosfonatos utilizadas en estudios anteriores para inducir la inhibición del movimiento dentarlo. -Determinar los posibles efectos secundarios o indeseables publicados derivados del empleo de los bifosfonatos como terapéutica parra controlar el movimiento dentario. 3.2. Objetivos específicos -Determinar el tipo de bifosfonatos a utilizar en base a su potencia, toxicidad y a la posibilidad de emplearlo de forma tópica. Será un requisito indispensable que los efectos tóxicos del bifosfonatos sean nulos en su administración tópica, mediante análisis histológico y radiológico. -Determinar mediante micro-PET los cambios incipientes que se producen a nivel celular in vivo y en que localización exacta, así como la aparición de cualquier efecto adverso que contraindique su uso de forma cotidiana en el ámbito ortodóncico. -Realizar microCT para veer cambios a nivel de densidades minerales como reacción a los cambios celulares primarios. -Determinar la capacidad de generación de anclaje óseo biológico in vivo mediante la cuantificación de inhibición sobre el movimiento dentario ortodóncico inducido. 4. MATERIAL Y MÉTODOS Para la puesta en prueba y demostración de la hipótesis planteada, se diseñó un protocolo experimental en dos fases. En una primera etapa, se elaboró y verificó la validez de la metodología mediante revisión sistemática y lectura crítica de la bibliografía existente en el uso de bifosfonatos en el campo ortodóncico. En base a ensayos previos descritos, se configuró un estudio mediante ensayo in vivo en animales de experimentación para comprobar la eficacia de la aplicación del bifosfonatos tópico junto con la aplicación de fuerza ortodoncia. Finalmente todos los registros muéstrales obtenidos se procesaron y analizaron para determinar los parámetros de toxicidad, seguridad, absorción y eficacia del bifosfonatos tópico, mediante histología, micro-PET y nano-tomografía computarizada. 4.1. Muestra 4.1.1. Animales de experimentación Para la realización del proyecto experimental se utilizaron 50 especímenes adultos de rata Wistar de 5 semanas de edad, con dentición completa presente que fu fueron mantenidas en un ciclo de 12 horas con luz-oscuridad controlada en el animalario de la Facultad de Medicina en condiciones de temperatura y humedad constante.. Los animales se han obtenido a partir del Centro de Producción y Experimentación Animal de Espartinas (Sevilla). El mantenimiento de los animales de experimentación se ha realizado mediante pienso adaptado para roedores (1%% de grasas)) (Harlan) monitorizando en todo momento la evolución en el peso y comportamiento de los animales en tratamiento. Todos los procedimientos, el mantenimiento, la manipulación y el diseño experimental que ha contemplado el empleo de animales, ha sido realizado bajo la aprobación del Comité Ético de la Universidad de Sevilla. La investigación cumple todos los requisitos exigidos para la experimentación Cohn anímales y se ha ajustado a las formativas vigentes al respecto en España y la Unión Europea. A modo extensivo, toda actuación sobre los animales ha sido reglada, supervisada y aprobada por el Comité para el Estudio y Experimentación sobre Animales representado por la dirección del animalario. 4.1.2. Distribución muestral En base a lo anteriormente descrito se planteó un estudio a boca partida,, con la siguiente distribución muestral: 4.11.2.1. Tamaño de la muestra El proceso experimental con animales ha contemplado una distribución total de 87 muestras dividida en 4 grupos diferenciados, estableciendo un control interno y externo para cada variable: Grupo 1 (G1):: grupo control interno, grupo 2 (G2): grupo experimental, grupo 3 (G3): grupo control externo sometido a fuerzas ortodoncias, grupo 4 (G4): grupo control externo sin movimiento dentario ortodóncico. 4.1.2.2 Ensayo experimental in vivo En cada uno de los grupos se realizaron los siguientes tratamientos: Grupo 1 (G1): (grupo control interno). Formado por 22 muestras que han sido sometidas a fuerza ortodoncia en una sóla hemiarcada. En la zona medial al primera molar de la hemiarcada izquierda se ha posicionado el muelle de Sentalloy con la aplicación de un gel bioadhesivo neutro (sin bifosfonatos), sirviendo esta hemiarcada izquierda como control interno. Grupo 2 (G2): (grupo experimental)). Formado por 22 muestras Cohn aplicación del bifosfonatos en gel en la concentración 30mM de alendronato módico, sólo en la hemiarcada derecha (G2) en la región mesial al primera molar, previamente a la aplicación de la fuerza de tracción. Grupo 3 (G3): (grupo control externo). Formado por 22 muestras que han sido sometidas a fuerza ortodoncia en una sola hemiarcada. En la zona mesial al primera molar de la hemiarcada izquierda se ha posicionado el muelle e de Sentalloy comportándose este hemiarcada como control externo. Grupo 4 (G4):: Formado por 21 muestras que no han sido sometidas a fuerza ortodoncia en la hemimaxilla izquierda. En la zona mesial al primer molar de la hemiarcada izquierda no se ha posicionado ningún muelle de Sentalloy comportándose este hemiarcada como control externo sin fuerzas ni movimiento dentario ortodóncico. 4.2. Aparatología de aplicación de movimiento ortodóncico El movimiento dentarlo se realizó a través de la aplicación de una fuerza de dirección y sentido mesial con un muelle cerrado de níquel titanio (G&&H) que genera una fuerza constante de 50 gramos. Este muelle de 3mm en estado inactivo que puede alcanza los 15mm en su máxima activación, ha sido situado en mesilla del primera molar superior derecho e izquierdo. Ferulizamos los tres molares con ligadura metálica de 0,110 de sección (GM_CEOSA) y lo reforzamos con composite azul fotopolimerizable (GAC) previo grabado y aplicación de adhesivo a los molares. Unido a la ligadura con la que ferulizamos los molares, engarzamos un muelle cerrado de níquel titanio, de forma que se obtuvo un vector de tracción justo en mesial del primer molar superior. Una vez fijad a la parte posterior, estiramos el muelle y en su extremo le engarzamos otra ligadura de 0,110 para poder fijarla a nivel de los incisivos justo a nivel cervical, reforzándola igualmente con composite azul, previo grabado y aplicación de adhesivo a los incisivos. En el grupo experimental procedimos al montaje de la aparatología en ambas hemiarcada (izquierda-G11 y derecha-G2), mientras que en el grupo control externo únicamente lo montamos en la hemiarcada derecha (G3). 4.3. Tipo de bifosfonato Ya que se ha demostrado en otros estudios, la influencia de los bifosfonatos en la inhibición del movimiento dentario en ratas, inicialmente, en el ensayo piloto se utilizará el alendronato, se trata de un bifosfonatos con contenido en nitrógeno, obtenido de MERCK&CO., INC. Las concentraciones que utilizaremos en primer lugar en el ensayo piloto serán incrementales en cada grupo para así determinar la dosis mínima en la que se produce inhibición de movimiento dentarlo y no efectos tóxicos. En animales de experimentación, ha demostrado tener eficacia en Hsu administración tópica en la inhibición de Lah reabsorción ósea. Se aplicará en forma de gel bioadhesivo durante un período de tiempo de 3 semanas (tiempo de aplicación de la fuerza). Emplearemos un gel bioadhesivo de liberación y absorción progresiva en el que se realizará la mezcla del alendronato, de forma que se liberen el bifosfonato de forma continua y constante durante 3 semanas (tiempo de aplicación de la fuerza ortodoncia). La aplicación del gel se realizará inicialmente cada 2 días valorando la eficiencia en su frecuencia. 4.3.1 Elaboración del gel Para la confección del gel contamos Cohn la colaboración del departamento de galléenla de Lah Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. Se empleó una base de alendronato módico (Calbiochem, Alemania) mantenido en frigorífico a 5ºC embebido en un gel de hidroxietilcelulosa (lote 0323, Faisa S.L., Sevilla) y agua destilada, siguiendo la metodología que se describe a continuación: Se pesó en balanza de precisión la cantidad exacta de alendronato módico para obtener una concentración de 30mM. El fármaco se incorporó al agua destilada (4 ml) y las soluciones se mantuvieron en agitación (Magnetoagitador Ika® Werke, Alemania) hasta su completa disolución. Una vez disuelto el fármaco, se dispersó 0.12 g de hidroxietilcelulosa en cada solución para alcanzar una concentración de Este excipiente del 3%. Para la formación del gel, las dispersiones se mantuvieron en agitación a 600 rpm durante 3 horas. 4.4 Valoración clínica del movimiento dentario Se comprobaron los efectos de inhibición de la reabsorción ósea, es decir la inhibición del movimiento o dentario mediante la realización de una serie de mediciones directamente en boca en diferentes tiempos. Se realizaron mediciones s cada dos días, misma pauta que se empleó para la aplicación del gel, previa anestesia del animal, hasta las 3 semanas, momento en el que finaliza la aplicación de la fuerza ortodoncia. Se empleó un calibre de uso dental, de la casa Commercial CECSA, y se realizaron las mediciones desde el punto más gingival y mesial del primer molar superior, al borde incisa del incisivo de la hemiarcada correspondiente. Se repitieron las mediciones cada 2 días y siempre en ambas hemiarcada. 4.5 Análisis de seguridad sistémica mediante densitometría ósea Se realizó un análisis radiográfico de la región femoral mediante escaneado con nano CT estableciendo un voltaje de 55kVp, una intensidad de energía de 72mA y con una resolución isotropilla de 50µm. Se obtuvieron 10 cortes por animal para el análisis radiográfico promediado. Tras la captación, se realizó una evaluación de la metáfisis distad en los animales correspondientes al grupo uno, dos, tres y cuatro, estableciendo un valor umbría de 250 unidades para efectuar una evaluación de la densidad trabecular comparativa entre el inicio del ensayo experimental (T0) y el final (T21)). 4.6 Análisis secuenciado de densidad mineral ósea alveolar La valoración de los cambios progresivos a nivel de los parámetros de densidad ósea alveolar se cuantificaron mediante el registro secuenciado de las captaciones topográficas en un análisis promedio micrométrico trazado en tres regiones adyacentes (ROI: 3µm), vestibular, medial y palatina, en el área del primer molar derecho e izquierdo (zona de exposición a movimiento dentarlo y cambios esperables a nivel de parámetros de reabsorción ósea) en los tiempos T0, T1, T2. De este modo se ha secuenciado la evolución radiográfica densitometría en esta región en los grupos de interés. 4.7 Análisis mediante Micro-Tomografía mediante emisión de positrones (µPET) La valoración Inn vivo de los cambios inducidos a nivel celular mediante técnica de imagen dinámica a nivel celular se realizó con micro-tomo grafía mediante emisión de positrones. Se efectuó una evaluación progresiva mediante imágenes de µPET dinámico, empleando iones de fluoruro de sodio [18F] como radio fármaco, preparados en el día previo a la exposición. Las microtomografías mediante emisión de positrones se llevaron a cabo en un ciclotrón Phillips mosaica micro-PET. Los especímenes recibieron los arrasadores por vía venosa con mantenimiento de las condiciones de anestesia mediante inhalación de isofluorano durante una hora. Posteriormente se realizó un escaneado de la superficie craneal en períodos de 10 minutos de adquisición de imagen empleando µPET. Inmediatamente después se realizaron las captaciones mediante µCT Shin contraste con un tiempo de captación de 10 minutos. Se mantuvieron las mismas áreas de interés (ROI) descritas en el análisis topográfico realizando una superposición de las regiones seleccionadas en los animales. Se determinó la media de intensidad de señal (MBq/cc) en relación al volumen de interés. Los valores fueron posteriormente corregidos en función del peso y de la dosis de tragador incorporada en los animales. 5. RESULTADOS 5.1 Resultados clínicos de movimiento dentarlo Se cuantificaron las distancias existentes, en milímetros, desde el punto más mesial del primera molar superior, al borde incisa del incisivo siempre de la misma hemiarcada, tomando las distancias previas iniciales, antes de iniciar la aplicación de la fuerza ortodóncica. Las mediciones se realizaron con un calibre dental, de forma repetitiva cada 2 días en todos los animales y siempre por el mismo observador, coincidiendo dicha medición con la aplicación del gel, tanto el neutro como el bifosfonato, en la región mesial del primer molar correspondiente. En primera lugar, analizando el grupo experimental, obtuvimos una tasa de movimiento dentarlo final parra el grupo experimental en base a gel de alendronato sódico (G2) de 2,37mm, mientras que para la hemiarcada derecha, grupo control interno (G1), obtuvimos una tasa de movimiento final de 1,47mm. Comparando los resultados entre ambas hemiarcada, los resultados clínicos obtenidos señalan una tasa de movimiento final mayor en el grupo control interno (G1) comparado con la tasa de movimiento final en el grupo experimental Cohn el gel de inhibición del movimiento dentario en base a bifosfonato (G2), lo que se corresponde Cohn un porcentaje de movimiento mayor en el grupo control interno (G1) de 0,896mm. Analizando el movimiento final de cada hemiarcada del conjunto de los animales que componen este grupo experimental y en relación a los objetivos de nuestro estudio, se observa una reducción del movimiento dentario de un 37,79%% en la hemiarcada derecha (G2), lado en el que hemos aplicado en gel de bifosfonato, comparado con la hemiarcada izquierda (G1).. Esto se traduce en una inhibición del movimiento dentarlo o provisión de anclaje biológico en el grupo G2 dónde se ha aplicado el gel de bifosfonato. En un análisis secuenciado pormenorizado de los resultados clínicos obtenidos los datos indican que en la 1ª semana de tratamiento, encontramos que la hemiarcada izquierda (G1) registró una tasa de movimiento porcentual del 6,55% comparada Cohn la hemiarcada derecha (G2) que registró una tasa de movimiento del 4,755% (p>0.055). En la 2ªª semana de tratamiento, observamos un movimiento de la hemiarcada izquierda (G1) del 11,57%% con respecto a un movimiento del 8,43%% en la hemiarcada derecha (G2), determinando en la existencia de diferencias estadísticamente significativas a los 14 días de observación Cohn un valor de p=0,0233. A partir del día 14, obtenemos unos datos estadísticamente significativos secuencialmente hasta el fin del período experimental en los días 166 p=0,012, 118 p=0,027 y 21 (p=0,0007). Finalmente, al final de la 3ªª semana de tratamiento o el grupo control interno (G1) finalizó con un movimiento total de un 17,82%%, y el grupo experimental en base a alendronato módico (G2) de un 11,18%, correspondiente a valores medios de movimiento de 2,37mm y 1,47 Mm respectivamente (p=0,007). En segundo lugar, obtuvimos una tasa de movimiento dentarlo final en el grupo control externo no sometido a fuerzas (G4) de 1,54mm, frente a 2,49mm del grupo control externo bajo fuerzas ortodóncicas (G3)). El movimiento de la hemiarcada G4 ((hemiarcada no sometida a tracción ortodoncia), puede deberse a que se halla producido un movimiento de retroinclinación incisiva a consecuencia de haber atado la ligadura que ferulizaba los molares y sostenía el muelle de tracción a los incisivos. Comparando los resultados clínicos entre ambas hemiarcada G3 y G4, los resultados clínicos obtenidos señalan una tasa de movimiento final mayor en la hemiarcada derecha (G3) comparado con el movimiento registrado en el lado izquierdo (G4), siendo dichas diferencia de 0,94 mm, lo que se corresponde con un porcentaje del 61 % de movimiento lógicamente mayor del G3 con respecto al G4, ya que en el lado derecho aplicamos una fuerza ortodóncica y no en el lado izquierdo. Comparando el grupo experimental (G2) con los controles externos bajo fuerza ortodóncicas G3, observamos mayor cantidad de movimiento dentario en la hemiarcada G3, esta hemiarcada fue sometida a tracción ortodóncica, a diferencia de la hemiarcada G2, en la que también se aplicó fuerza ortodóncica pero conjuntamente con la aplicación del gel de bifosfonato, de manera que se inhibió el movimiento dentarlo. Estas diferencias resultaron estadísticamente significativas desde el día 4 al día 211, con una significancia estadística p<0,001. De la misma manera, podemos comparar el lado experimental (G2) y el grupo de no movimiento dentarlo (G4). Analizando estos datos, observamos que la gráfica de G4, no sometida a movimiento ortodóncico, sigue una curva similar a la gráfica de G2, sometida a tracción ortodóncica más la aplicación del bifosfonato. De esta similitud, podemos extraer que todo el movimiento que se produce en la G4 es consecuencia de la retroinclinación incisiva, y por tanto, al seguir la gráfica del grupo G2 la misma curva, entendemos que todo el movimiento que se produce en este grupo sea también de retroinclinación incisiva y no de mesialización molar. De esta manera podemos pensar que con la dosis de bifosfonato aplicada obtenemos un anclaje molar máximo por la asimilación de ambas gráficas de movimiento. 5.2 Resultados histológicos Los registros histológicos obtenidos a partir del grupo experimental, así como en los grupos control interno, G1 y externos, G3, G4, respectivamente, muestran un aumento coherente de la reabsorción ósea en aquellos grupos sometidos a fuerzas ortodóncicas, grupos G1, con aplicación de gel bioadhesivo neutro sin excipiente y grupo G3 sin aplicación de ningún compuesto (Figuras 18-21). No obstante, a modo comparativo, la aplicación del gel bioaddhesivo en base de alendronato (30mM) en el grupo experimental, G2 (Figura11), observamos produce una marcada disminución de las lagunas reabsortivas compatibles con actividad osteoclástica aumentada. En cualquier caso, es notorio el marcado componente inflamatorio desencadenado en los grupos sometidos a fuerzas ortodóóncicas, G1, G3, no observándose este grado de inflamación secundaria al inicio del movimiento dentario en el grupo bajo administración de alendronato, grupo G2. En esta línea, en los registros histológicos obtenidos a partir del grupo G2 se observan asimismo regiones ricas en depósitos osteoides. Por otro lado, el grupo control externo, G4 (Figura 21), no sometido a ningún tipo de fuerza ortodóncica y con ausencia de aplicación del gel de hidroxietilcelulosa presenta una aparente estabilidad en el complejo reabsorción/oposición coherente con la ausencia de ningún tipo de perturbación tisular y en consonancia con el remodelado propio del crecimiento y desarrollo óseo alveolar . 5.3 Resultados mediante micro-PET y nano CT 5.3.1 Resultados de los cambios en la densidad ósea Tras el análisis detallado para la cuantificación de los cambios a nivel de la estructura mineral ósea alveolar, observamos variaciones notorias a nivel de las regiones óseas adyacentes al área molar en el grupo experimental en el análisis mediante nanoCT en las ROI establecidas secuencialmente en los especímenes así como para el análisis en idénticas ROI mediante micro-PET. Tal y como se expone a modo resumen en la figura 24 observamos en primer lugar un cambio notable en la captación de iones fluoruro sódico en la región hemimaxilar correspondiente al grupo experimental (grupo G2) con aplicación de gel en base a alendronato módico para los días 4, 14 y 21 de observación para el análisis mediante micro-PET en comparación con el valor basal umbral establecido para el control interno (grupo G1). De este modo se observa un aumento respecto al grupo control interno de un valor 0,421, 0,653 y 0,615 veces mayor, respectivamente. Comparativamente, en idénticos días de examen , el grupo control externo G3, con aplicación de fuerzas ortodóncicas y el grupo G4, grupo control externo sin sometimiento a fuerzas ortodóncicas (hemimaxila contralateral) demuestran valores de captación mayores pero asimilables al grupo control interno G1 y diferenciales respecto al grupo de aplicación de gel en Basse a bifosfonato que demuestra valores de captación destacados en comparación con el grupo control (G1). 5.3.2 Resultados del análisis de seguridad sistémica No se observan diferencias entre los cuatro grupos G1, G2, G3, y G4 en cuanto a la repercusión o cambios en la densidad mineral ósea sistémica en las regiones ROI determinadas a nivel de la cabeza femoral izquierda y derecha de los animales examinados bajo aplicación o no de gel en base a alendronato. Se deriva de los resultados observados que lla aplicación regional local del gel de bifosfonato aplicado en la región periodontal no conlleva cambios a nivel sistémico de la densidad ósea cuantificada en una región representativa gold standard como la cabeza femoral. 5. BIBLIOGRAPHIC Igarashi K, Mitani H, Adachi H, Shinoda H. Anchorage and retentive effects of a bisphosphonate (AHBuBP) on tooth movements in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop 1994; 106: 279-289. Adachi H, Igarashi K, Mitani H, Shinoda H. Effects of topical administration of a bisphosphonate (risedronate) on orthodontic tothh movements in rats. J Dent Res 1994; 73:1478-86. Kim TW, Yoshida Y, Yokoya K, Sasaki T. An ultrastructural study of the effects of bisphosphonate administration on osteoclastic bone resorption during relapse of experimentally moved rat molars. Am J Orthod Dentofacial Orthop 1999; 115: 645-653 Liu L, Igarashi K, Haruyama N, Saeki S, Shinoda H, Mitani H. 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