Obtención de plantas transformadas de albaricoquero libres de marcadores

Resumen

El albaricoquero (Prunus armeniaca L.), es una de las especies más relevantes dentro de los frutales de hueso, en los países de la Cuenca Mediterránea a nivel económico. En los últimos años la aparición del virus PPV (Plum Pox Virus) ha mermado la extensión del cultivo en Europa. Muchos programas de mejora genética se han centrado en producir variedades resistentes al citado virus. La transformación genética podría permitir la obtención de variedades mejoradas mediante cambios discretos en variedades élite y en un plazo relativamente corto, una vez que los protocolos estén desarrollados. El desarrollo de los protocolos de transformación está muy limitado por la regeneración de yemas o embriones adventicios. La regeneración es dependiente de muchos factores y uno de los más importantes es el genotipo. Un gran avance sería lograr protocolos de transformación independientes del genotipo. En esta tesis se han estudiado varias metodologías para poder desarrollar un protocolo de estas características, basado en la utilización de meristemos o células con capacidad meristemática y de agregados meristemáticos. Se ha conseguido transformar dos variedades de albaricoquero, Helena y Rojo Pasión. Sin embargo, hemos detectado que con mucha frecuencia se producen plantas quiméricas al transformar las células meristemáticas. Un requisito necesario para poder disociar estas quimeras o para evitar su producción es disponer de un método que nos permita discriminarlas de forma cuantificable, consistente, rápida y sencilla. Con los métodos actuales, basados en genes marcadores visuales o técnicas de hibridación, no se pueden discriminar las quimeras de las plantas uniformemente transformadas, tal y como demostramos en esta tesis. Por lo tanto, se ha desarrollado una metodología basada en PCR cuantitativa en tiempo real que nos permite identificar quimeras y diferenciarlas de tejidos uniformemente transformados. Otro inconveniente en los protocolos de transformación es la utilización de genes marcadores. Estos genes producen un rechazo social e incluso existe una directiva europea (2001/18/CE) que regula las plantas transformadas con genes de resistencia a antibióticos. En la presente tesis se han estudiado dos sistemas de obtención de plantas transformadas libres de marcadores. El sistema de transformación MAT (Multi Autonomous Transformation) que combina el gen ipt, gen promotor de la regeneración, con el sistema de escisión R/RS y la recombinasa R controlada por un promotor constitutivo ha sido estudiado. También se ha evaluado el sistema Cre/LoxP que emplea la recombinasa CRE controlada por un promotor inducido químicamente. Ambos sistemas presentaron ventajas e inconvenientes. La construcción MAT indujo una mejor regeneración y eficiencias de transformación más elevadas que las publicadas hasta la fecha, debido a la introducción del gen ipt. Sin embargo, obligó a modificar el protocolo de transformación puesto que las hojas de albaricoquero no fueron capaces de sobrevivir en un medio sin reguladores del crecimiento. Además, la falta del fenotipo característico ipt-shooty en los brotes transformados de albaricoquero no permitió la utilización de este gen como marcador de selección lo que complicó enormemente la evaluación de los mismos y de la escisión del casete con los genes marcadores. El plásmido pX6-GFP con el sistema de escisión Cre/loxP permitió la utilización de nuestro protocolo habitual, aunque con las eficiencias de transformación ya descritas anteriormente a partir de hojas de albaricoquero. La escisión pudo ser controlada induciendo la expresión de la recombinasa CRE y por lo tanto resultó mucho más fácil la evaluación de la misma. Se ha demostrado que con estos sistemas se pueden eliminar los genes marcadores de las plantas transformadas de albaricoquero. Este trabajo permitirá, en un futuro, decidir la construcción más adecuada para producir plantas de albaricoquero transformadas que sólo contengan los genes de interés y que quizás así puedan ser más fácilmente comercializadas y aceptadas por el consumidor.