Biotechnological production of antioxidan petalains and evaluation of their functional capacity in the in vivo model Caenorhabditis elegans

Resumen

Las propiedades antioxidantes, antitumorales y antiinflamatorias de las betalaínas se han estudiado principalmente mediante el uso de extractos de plantas del orden Caryophyllales. La producción y purificación de betalaínas a partir de partes comestibles de las plantas han sido factores limitantes en el análisis de compuestos individuales. Además, la falta de estudios con betalaínas individuales puras ha dificultado la confirmación inequívoca de las betalaínas como compuestos que promueven la salud y la caracterización de las estructuras más activas. Así, los objetivos de esta Tesis fueron: 1. Búsqueda de fuentes alternativas de dioxigenasas formadoras de ácido betalámico a través de la extracción de enzimas en hospedadores no nativos. 2. Producción biotecnológica de betalaínas individuales mediante la expresión heteróloga de enzimas DODA eficientes en cultivos bacterianos. 3. Construcción y optimización de una máquina para el control automático del tiempo de vida de los gusanos y su aplicación en la caracterización de betalaínas. 4. Análisis de cambios transcripcionales en gusanos tratados con betalaínas y posterior confirmación biológica mediante el uso de cepas mutantes de C. elegans. Los resultados obtenidos han demostrado que la síntesis de betalaínas no se limita a las plantas. Las dioxigenasas microbianas descritas en esta Tesis Doctoral presentan una mayor actividad y afinidad que las caracterizadas de origen vegetal. Gracias a la actividad superior de la enzima DODA de Gluconacetobacter diazotrophicus, los primeros pasos en la biosíntesis de betalaínas se han establecido por primera vez. La clonación de esta enzima novedosa y eficiente ha llevado a la puesta en marcha de un sistema de producción biotecnológica de pigmentos individuales que mejoró el rendimiento de las metodologías anteriores. Este novedoso enfoque biotecnológico permitió un estudio más profundo de las propiedades físico-químicas de las betalaínas y la obtención de nuevos compuestos desconocidos como la quitosano-betaxantina, la primera betaxantina polimérica fluorescente que podría combinar las propiedades fluorescentes de las betalaínas y las propiedades del quitosano, un polímero de azúcar ampliamente utilizado con fines médicos. Además, el análisis de las propiedades de cada betalaína como compuestos bioactivos ahora es posible. Estas propiedades se analizaron utilizando Caenorhabditis elegans, un pequeño nematodo ampliamente utilizado como modelo animal debido a su ciclo de vida rápido y simple y su fácil mantenimiento en el laboratorio. El tiempo de vida de C. elegans es un parámetro ampliamente utilizado para describir el efecto de diferentes moléculas en el envejecimiento de este modelo animal. Con este propósito, se construyó la máquina "Lifespan Machine", una plataforma automática para el análisis del tiempo de vida. Así, el análisis de diecisiete betalaínas individuales mostró que su consumo prolonga la vida de los gusanos. El mecanismo molecular que subyace a este efecto se analizó utilizando cepas mutantes y realizando ensayos de microarrays a partir de la extracción de ARN de gusanos alimentados con betalaínas. Los resultados mostraron que las betalaínas modulan la expresión de daf-16 o skn-1, genes ortólogos a FOXO y Nrf2 humanos, respectivamente. En ambas especies, estos genes están involucrados en vías relacionadas con la longevidad y la resistencia al estrés oxidativo y conducen a la sobreexpresión de genes hsp que codifican las proteínas HSP involucradas en la resistencia al cáncer y al Alzheimer. Por lo tanto, los resultados obtenidos pueden abrir nuevas líneas de investigación en la búsqueda de tratamientos efectivos basados en estas moléculas de origen vegetal. Paralelo al tema principal, el dispositivo para el análisis automático del tiempo de vida de C. elegans facilitó el estudio de otros compuestos individuales, tanto naturales como sintéticos. Los efectos que promueven la salud de seis flavonoides estructuralmente relacionadas, así como el daño producido por la administración de seis colorantes alimentarios artificiales, se establecieron mediante el uso de la máquina "Lifespan Machine" y del uso de varias técnicas de microscopía. Además, el análisis de microarrays realizado con gusanos tratados con estos compuestos mostró sus genes diana y cómo el consumo de estos compuestos es capaz de modular vías relacionadas con la longevidad o el estrés oxidativo.