Characterization of Caiap and Wdr90 as novel inflammasome components involved in the resistance to Salmonella enterica serovar Typhimurium

Resumen

Los inflamasomas son plataformas moleculares citosólicas que alertan al Sistema inmunitario de la presencia de infecciones. Como complejos multiproteicos, están constituidos por NLRs (Receptores tipo NOD), proteínas adaptadoras (ASC) y caspase-1. El ensamblaje de los complejos requiere una señal activadora y depende de interacciones homotípicas. Nuestro laboratorio ha encontrado que la proteína 4 que une a guanilato (Gbp4), una GTPasa inducible por IFN? con un dominio CARD C-terminal, se necesita para la eliminación de Salmonella Typhimurium (ST) dependiente de inflamasoma realizada por los neutrófilos in vivo. Aunque muchos de los componentes clave del inflamasoma ya han sido caracterizados, aun se conoce muy poco acerca de otros componentes potenciales. En esta Tesis Doctoral se describen dos nuevos componentes del inflamasoma y se han desarrollado además anticuerpos en alpacas contra componentes del inflamasoma como una herramienta para clarificar el ensamblaje del inflamasoma y su función. Por un lado, describimos la identificación de una proteína evolutivamente conservada, a la que nombramos como Caiap (proteína adaptadora del inflamasoma con dominio CARD y ANK), que presenta un dominio CARD N-terminal, 16 dominios ANK C-terminales y que se necesita para la resistencia a ST dependiente de inflamasoma en pez cebra. Enigmáticamente, Caiap está muy conservada desde peces cartilaginosos hasta marsupiales, pero se encuentra ausente en mamíferos placentarios. El mecanismo de actuación de Caiap ocurre aguas debajo de flagelina e interacciona con Caspa catalíticamente activa, el homologo funcional de caspasa-1 humana, a través de sus dominios ANK, mientras que los dominios CARD promueven su oligomerización. Nuestros resultados apuntan por tanto a que proteínas con dominios ANK son adaptadores clave necesarios para la estabilización funcional de caspasa-1 en complejos de alto peso molecular. Por otro lado, se describe cómo wdr90 en pez cebra se induce por Gbp4 de manera independiente de la activación del inflamasoma. Este gen codifica para una proteína de alto peso molecular con numerosos dominios WD40, que están involucrados en coordinar el ensamblaje de complejos multiproteícos, cuya función era desconocida hasta la fecha. Se ha visto como su sobreexpresión aumenta los niveles de actividad caspasa-1 y la resistencia a ST en larvas infectadas de pez cebra, actuando aguas arriba de Caspa y Asc. Además, se muestra como su expresión en HEK293T es capaz de alterar la distribución de NLRC4, pero no de NLRP3 y AIM2. Por último, hemos generado un knockout de WDR90 en líneas inmortalizadas de macrófagos de ratón y herramientas CRISPR para generar un knockin con el fin de marcar el WDR90 con un epítopo FLAG para facilitar su detección. Asimismo, se han producido anticuerpos en alpaca contra Asc de pez cebra y WDR90 humano, lo que facilitará en un futuro a comprender en mayor detalle el ensamblaje, activación y la función biológica del inflamasoma.