Characterization of the purinergic receptor P2X7 and the NLRP3 inflammasome in the inflammatory response induced by antimicrobial peptides and infections

Resumen

En esta Tesis se describe como el péptido antimicrobiano melitina induce la activación canónica del inflamasoma NLRP3 debido a una permeabilización de la membrana plasmática y una reducción de la concentración de K+ intracelular. Tras el tratamiento con melitina, la proteína ASC fue necesaria para activar caspasa-1 e inducir liberación de IL-1Beta. Sin embargo, la muerte celular inducida directamente por melitina permeabilizando la membrana plasmática evitó la amplificación de la activación de caspasa-1, la liberación de IL-18, y la ejecución de piroptosis. Por lo tanto, la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por melitina resultó en una respuesta atenuada del inflamasoma que no indujo la muerte celular dependiente de caspasa-1. Además, se estudió una cohorte de pacientes con sepsis de origen intra-abdominal (n=35), donde se encontró que la activación del inflamasoma NLRP3 mediada por ATP estaba alterada en un grupo de pacientes entre las primeras 24h del desarrollo de sepsis. Estos pacientes presentaron una respuesta inmune inmunocomprometida y acumularon la mayor parte de muertes asociadas al proceso séptico. En pacientes sépticos immunocomprometidos P2X7 se asoció a la disfunción mitocondrial en monocitos, pero no a la activación del inflamasoma NLRP3. La activación del receptor P2X7 en monocitos antes de la estimulación microbiana dio lugar a una inhibición del inflamasoma NLRP3 por un daño mitocondrial. Se determinaron varios marcadores para gravedad en sepsis y citoquinas circulantes en plasma en el primer día del desarrollo de sepsis, que no fueron capaces de mostrar dicha estratificación de este grupo de pacientes sépticos con una alta mortalidad. Nuestros datos revelaron un mecanismo molecular iniciado por P2X7 que contribuye a la inmunosupresión en monocitos con sepsis, que podría ser un nuevo biomarcador temprano de la mortalidad. No menos importante, se encontró que los macrófagos y las células HEK293 activadas a través de P2X7, redujeron su capacidad de adhesión al sustrato en un tiempo reducido y de una forma dosis-dependiente. Estos datos indicaron que la adhesión celular al sustrato en macrófagos no activados es más alta que la adhesión a células HEK293 a la placa de cultivo y a distintas matrices extracelulares (ECMs). Este fenómeno es a través de la liberación celular de la integrina Beta1 inducida por la activación del receptor P2X7, haciendo que perdieran la adhesión al sustrato plástico y a colágeno tipo I, pero no a fibronectina o laminina. Aunque la adhesión celular aumentó rápidamente después de tratar los macrófagos con LPS bacteriano, tras la estimulación con ATP, la adhesión disminuyó radicalmente independientemente del sustrato dónde estuvieran plaqueados. En estas condiciones la muerte celular inducida por piroptosis tras la activación del receptor P2X7 induce de forma no selectiva la pérdida de la adhesión celular. Estos resultados revelaron que el receptor P2X7 está activamente asociado en el proceso de adhesión de macrófagos.