Desarrollo y aplicación de la tecnología CRISPR para el estudio de procesos reproductivos en mamíferos

Resumen

El desarrollo de endonucleasas específicas sitios en los últimos años ha facilitado en gran medida la tarea de lograr una mutación en un lugar específico del genoma. Estas tecnologías incluyen la incorporación más notoria y reciente: CRISPR-Cas9. Mediante esta tecnología, pueden lograrse directamente modificaciones en un lugar específico del genoma mediante la transmisión de los componentes de CRISPR a un cigoto, evitando así la necesidad de células intermedias. Este avance facilita enormemente el proceso en ratones y, especialmente, en otras especies en las que, en ausencia de células madre, se requería la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), para generar mutagénesis dirigida. Además, la generación de mutantes en un solo paso permite el estudio de la función génica durante el desarrollo embrionario sin necesidad de mantener colonias de animales mutantes. Si bien CRISPR puede aplicarse prácticamente a cualquier especie, la optimización técnica es crucial para reducir el tiempo, los embriones y los animales necesarios para un proyecto concreto. En los dos primeros capítulos de esta tesis, se realizaron estudios para optimizar esta tecnología para la edición del genoma en el modelo bovino. En el capítulo 1, se desarrollaron estrategias que persiguen disminuir las tasas de mosaicismo genético después de la inyección de CRISPR, ya que éste es un fenómeno indeseable por reducir en gran medida la probabilidad de obtener individuos knock-out (KO). Para ello, se estudiaron dos protocolos alternativos de fecundación in vitro (FIV) e inyección de CRISPR con el fin de lograr edición génica antes de la primera replicación del ADN del embrión. El capítulo 2 tenía por objeto aumentar la eficiencia de inserción de una secuencia concreta en un locus genómico específico (knock-in, KI). Los resultados de este capítulo muestran que la exposición transitoria a RS-1 (un potenciador de la reparación dirigida por homología) 7,5 µM tiene un efecto positivo en las tasas de KI. La tecnología CRISPR también facilita la edición del genoma en pequeños mamíferos, los cuales presentan la ventaja de tener intervalos generacionales más cortos. En los capítulos 3 y 4, se generaron modelos KO en ratones y conejos, respectivamente, con el objetivo de comprender la función de dos genes específicos en procesos reproductivos. En el capítulo 3, se generaron ratones KO para Tmem95. La ablación génica de Tmem95 en ratones dio lugar a esterilidad masculina. El esperma desprovisto de Tmem95 fue incapaz de fertilizar los ovocitos por monta natural o por FIV, a pesar de poder atravesar la zona pelúcida, y mostrar morfología y motilidad normales. Experimentos posteriores demostraron que los espermatozoides que carecían de TMEM95 no podían fusionar su membrana con la del ovocito, si bien se pudo obtener progenie al sortear la fusión esperma-ovocito mediante ICSI. Por último, en el capítulo 4 se estudió el papel de la proteína ZP4 de la zona pelúcida generando conejos KO para ZP4. La función de ZP4 era desconocida hasta la fecha debido a la ausencia de esta proteína en el ratón de laboratorio. Las conejas sin ZP4 mostraron una fertilidad extremadamente reducida porque las zonas pelúcidas desprovistas de ZP4 fueron incapaces de proteger los embriones de las dificultades mecánicas que estos se encuentran durante su viaje a través del tracto genital femenino. En resumen, esta tesis proporciona estrategias para aumentar la eficiencia de la generación de KO y KI utilizando CRISPR en bovino. Estas estrategias sientan las bases para futuros estudios de la función génica durante el desarrollo embrionario o la generación de modelos mutantes en grandes mamíferos utilizando esta tecnología. También se aplicó la tecnología CRISPR para generar modelos KO en otras dos especies de mamíferos (ratones y conejos). Estos modelos KO han servido para descubrir las funciones de dos genes (TMEM95 y ZP4) que juegan un papel destacado en la reproducción de los mamíferos.