Estudio estructural y aplicaciones biomédicas de los módulos de unión a colinaantimicrobianos frente a streptococcus pneumoniae

Resumen

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una de las bacterias mundialmente más relevantes causante de varias enfermedades como neumonías, meningitis y otitis media. La vacunación contra neumococo y el tratamiento con antibióticos constituyen dos estrategias de lucha contra este patógeno que resultan incompletas debido a la enorme variedad serotípica de este microorganismo y a los crecientes niveles de resistencia a los antibióticos. Estos problemas inducen a la búsqueda de dianas terapéuticas alternativas frente a las que se desarrollen nuevos antimicrobianos que soslayen las complicaciones derivadas de la resistencia a antimicrobianos. Las proteínas de unión a colina (CBPs) de S. pneumoniae comprenden una familia de polipéptidos modulares involucrados en eventos esenciales para la viabilidad y virulencia de este patógeno. Las CBPs reconocen los residuos de colina presentes en los ácidos teicoicos utilizando los llamados módulos de unión a colina (CBMs), constituidos por motivos repetidos de unos 20 residuos (CBRs, repeticiones de unión a colina). El propósito principal de esta Tesis Doctoral es el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos frente a S. pneumoniae, focalizando la investigación en la familia de las CBPs. En concreto la Tesis se puede dividir en tres líneas en base a cada uno de los compuestos estudiados: Ésteres de aminas bicíclicas (EBAs) Los EBAs son análogos de colina que se diseñaron inicialmente como inhibidores de las CBPs, sin embargo, estudios anteriores demostraron actuar como inhibidores del crecimiento de S. pneumoniae presentando una actividad lítica inesperada. En este trabajo se demuestra que los EBAs actúan como desestabilizadores de la membrana celular. Se ha analizado la actividad inhibidora y desintegradora de los EBAs en biopelículas neumocócicas, el compuesto EBA 31 produjo el mayor efecto sobre las biopelículas de S. pneumoniae, así como en biopelículas mixtas de S. pneumoniae y Haemophilus influenzae no tipificable. Además, los EBAs resultaron ser efectivos frente a la proliferación de promastigotes de Leishmania donovani. Estos resultados respaldan el papel de los EBAs como una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos antimicrobianos de amplio espectro, debido posiblemente a su capacidad desestabilizadora de la membrana celular, siendo efectivos frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como frente a patógenos eucariotas. Módulos de unión a colina (CBMs) Se ha estudiado la capacidad de tres CBMs naturales (C-ClytA, C-Cpl1, C-CbpD) y un derivado (LZ-C-LytA) para competir con los CBPs del huésped por el acceso a la colina en la superficie bacteriana, con el objetivo de interferir con la actividad de este último. La interacción de los CBMs con colina libre y mímicos sintéticos de la pared celular se evaluó mediante espectroscopía de fluorescencia y dicroísmo circular, así como resonancia de plasmón superficial. Por otro lado, la adición exógena de CBM a cultivos planctónicos neumocócicos causó el encadenamiento celular, la agregación y la sedimentación bacteriana. Este resultado nos llevó a evaluar la capacidad de los CBMs para promover la fagocitosis bacteriana por los macrófagos peritoneales, lo que sugiere que estos polipéptidos podrían constituir la base para candidatos antimicrobianos prometedores basados en la inducción natural del sistema de defensa del huésped. Péptidos derivados de la autolisina de LytA Estudios previos del laboratorio habían demostrado que la secuencia de un CBR aislado de la autolisina LytA (P4A) dispone de toda la información necesaria para adquirir una estructura similar a la nativa y siendo capaz de reconocer específicamente la colina, aunque con afinidad residual. Con el propósito de encontrar el mínimo requerimiento estructural necesario para obtener un efecto similar al obtenido en las CBMs se llevó a cabo el estudio de versiones simplificadas, del péptido P4A y construcciones derivadas de éste por duplicación y triplicación de la misma secuencia en tándem (P4B y P4C). Se evalúo la interacción de los péptidos por colina libre, así como se estudió el cambio conformacional de horquilla β a hélice α inducido por micelas de detergente. Se comprobó que los péptidos P4B y P4C ejercen un efecto bactericida sobre cultivos in vitro de neumococo debido a la salida prematura de la amidasa LytA causada por la perturbación de la membrana celular. Con el propósito de incrementar su eficacia por efectos de multivalencia se procedió al diseño de dendrímeros conteniendo varias copias del péptido P4A (g2-P4A y g3-P4A). Los compuestos g2-P4A y g3-P4A provocaron la destrucción bacteriana a bajas concentraciones (orden nanomolar) mediante un mecanismo independiente de las enzimas líticas del patógeno y de la presencia de colina en la superficie. Finalmente se evalúo la eficacia del dendrímero g3-P4A en modelos animales de pez cebra demostrando ejerce un efecto protector frente a enfermedad neumocócica.