Papel de los reguladores moleculares fbp1 y bmh2 en la virulencia de fusarium oxysporum

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª Cristina de Miguel Rojas TÍTULO: "Papel de los reguladores moleculares Fbp1 y Bmh2 en la patogénesis de Fusarium oxysporum" 1. Introducción o motivación de la tesis El objetivo general de la tesis ha sido profundizar en el conocimiento de las bases moleculares que determinan la virulencia del hongo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, un patógeno que infecta plantas de tomate a través de la raíz, además de infectar a personas inmunodeprimidas . Así, F. oxysporum ha sido propuesto como el primer modelo de patógeno multihospedador en hongos . En este trabajo se han investigado algunas bases moleculares que determinan la patogenicidad, estudiando la importancia de una proteína F-box que participa en la rápida y específica degradación de proteínas por el sistema proteasoma-ubiquitina. Recientemente se han identificado en Fusarium dos proteínas F-box del complejo SCF implicadas en la patogénesis, Frp1 en Fusarium oxysporum y FBP1 en Fusarium graminearum . Se han realizado estudios in silico en el genoma de Fusarium oxysporum para identificar el ortólogo de estos genes y posteriormente se ha caracterizado el gen fbp1 durante el proceso de infección mediante la interrupción dirigida del mismo. Uno de los objetivos principales de este trabajo ha sido identificar posibles proteínas diana del complejo SCFFbp1. Se planteó la hipótesis de que la ausencia de Fbp1 impide la degradación de las proteínas diana por el proteasoma 26S, y por tanto, éstas deberían ser más abundantes en la cepa mutante ¿fbp1 que en la cepa silvestre. Para desarrollar nuestra hipótesis se llevó a cabo un abordaje proteómico. 2. Contenido de la investigación El análisis in silico del genoma de Fusarium oxysporum reveló la presencia de 53 proteínas F-box. De entre ellas, la proteína codificada por el gen FOXG_04438 es la ortóloga a Fbp1 en F. graminearum . Para estudiar el papel del gen fbp1 en la virulencia de F. oxysporum se llevó a cabo la interrupción dirigida del gen en la estirpe silvestre del hongo mediante la técnica de PCR de fusión . La infección de plantas de tomate inoculadas con los mutantes deficientes en el gen muestró un retraso en el proceso de infección, lo que indica que Fbp1, aunque no es esencial para la patogenicidad, es necesaria para la completa virulencia de F.oxysporum. El mutante ¿fbp1 mostró un retraso significativo en todas las fuentes de carbono y nitrógeno analizadas, además de un patrón de crecimiento ondulado de las hifas líder y una tinción del Spk muy abundante y deslocalizada. Mutantes de F. oxysporum en el gen fbp1 mostraron niveles reducidos de fosforilación de Fmk1 y compartían características fenotípicas con los mutantes ¿fmk1, tales como defectos en el crecimiento invasivo, en la colonización del tejido vivo de la planta y en la capacidad de fusión vegetativa . Por otro lado, los bajos niveles de fosforilación de la MAPK Mpk1 que exhibió el mutante nulo fbp1 junto con la sensibilidad a compuestos como SDS y CFW, sugieren que Fbp1 contribuye al mantenimiento de la integridad celular. Realizamos un análisis proteómico, en condiciones de crecimiento invasivo, para conocer las proteínas diferencialmente expresadas en la cepa mutante ¿fbp1 y poder así identificar posibles dianas del complejo SCFFbp1. De las 41 proteínas identificadas, 17 de ellas estaban sobre-expresadas en el mutante ¿fbp1 y relacionadas con funciones susceptibles de sufrir ubiquitinación: transporte, proteolisis, respuesta a estrés y organización de los componentes celulares. Una de las proteínas más sobre-expresadas en el mutante ¿fbp1 fue la codificada por el gen FOXG_00146, una proteína 14-3-3 anotada en la base de datos como Bmh2. Las proteínas 14-3-3 son proteínas diméricas, altamente conservadas e implicadas en una gran cantidad de funciones celulares. El análisis in silico del genoma de F. oxysporum reveló la existencia de dos proteínas 14-3-3, Bmh1 (FOXG_01979) y Bmh2 (FOXG_00146). Ambas proteínas presentan una gran similaridad, sin embargo la interrupción dirigida de ambos genes mostró que Bmh1 no parece tener ningún papel en los fenotipos analizados. Bmh2 participa en la resistencia a rapamicina y su deleción supone una reducción del crecimiento en los distintos medios analizados, por lo que sugerimos que el mutante ¿bmh2 tiene afectada la ruta de señalización TOR. La pérdida de Bmh2 pero no de Bmh1 resultó en una reducción parcial de la virulencia en plantas de tomate. Aunque Bmh2 no es esencial para el crecimiento invasivo, si parece jugar un papel importante ya que un mutante con la proteína Bmh2 truncada (carece del a ¿-hélice 9) fue capaz de atravesar la membrana de celofán incluso en presencia de amonio, a diferencia del mutante ¿bmh2 . 3. Conclusión De entre todas las proteínas F-box que contiene el genoma de F. oxysporum f. sp. lycopersici la aquí caracterizada está implicada en patogénesis. El análisis proteómico nos ha aportado un conjunto de posibles dianas de degradación del sistema SCFFbp1 que nos indica la variedad de procesos celulares que son susceptibles de sufrir degradación por ubiquitinación. Esta ubiquitinación no sólo tiene una función de degradación sino también de regulación de las distintas vías de señalización intracelular . Los bajos niveles de fosforilación de la kinasa Fmk1 indican que Fbp1 regula la cascada de señalización MAPK Fmk1 y además se localiza aguas arriba de ésta. Nuestros resultados también conectan la función de Fbp1 con la cascada de señalización MAPK Mpk1, sugiriendo que esta ruta puede tener múltiples activadores aguas arriba que pueden ser sustratos de Fbp1 para su ubiquitinación, tal y como está descrito en levaduras . De las dos proteínas 14-3-3 que presenta Fusarium oxysporum únicamente una parece tener funcionalidad en todos los fenotipos analizados. Al tratarse de reguladores moleculares que intervienen en multitud de procesos es de esperar que su delecion tenga efectos pleitrópicos. 4. bibliografía Di Pietro A, Garcia-Maceira FI, Meglecz E, Roncero MI (2001) A MAP kinase of the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum is essential for root penetration and pathogenesis. Mol Microbiol 39: 1140-1152 Di Pietro A, Madrid MP, Caracuel Z, Delgado¿Jarana J, Roncero MIG (2003) Fusarium oxysporum: exploring the molecular arsenal of a vascular wilt fungus. 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