Desarrollo y validación de metodologías analíticas para la determinación de proteínas de soja en productos cárnicos por cromatografía líquida de perfusión

Resumen

Debido a la ausencia de métodos analíticos fiables, en este trabajo, se han desarrollado y validado nuevas metodologías analíticas para la determinación de proteínas de soja en productos cárnicos crudos y procesados utilizando HPLC con fases estacionarias perfusivas. Las metodologías desarrolladas consistían en el desgrasado de las muestra con acetona, solubilización de las proteínas de soja en un medio salino a pH básico y análisis de las proteínas extraídas por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Fase Inversa (RP-HPLC) de perfusión con detección UV y elución en gradiente. También se han optimizado las etapas de extracción y separación. Las mejores condiciones que permitían la extracción de las proteínas de soja utilizaban una disolución reguladora Tris-HCl a un pH 8.0 (que en algunos casos podía contener un modificador) con agitación ultrasónica y centrifugación obteniendo un sobrenadante que era directamente inyectado en el sistema cromatográfico. El método de RP-HPLC de perfusion elegido consistía en un gradiente lineal y binario en tres etapas: 5-25 % B en 0.8 min, 25-42 % B en 0.8 min, 42-50 % B en 0.6 min, y finalmente 50-5 % B en 0.5 min para equilibrar la columna en las condiciones iniciales entre inyecciones, siendo la fase móvil A y B, 0.05 % (v/v) de ácido trifluoroacético en agua y 0.05 % (v/v) de ácido trifluoroacético en acetonitrilo, respectivamente. Se empleó una columna de perfusion en fase inverse (50 x 4.6 mm d.i.) empaquetada con partículas de 10 ?m de diámetro de poliestireno-divinilbenzeno, un flujo de fase móvil de 3 mL/min, una temperatura durante la separación de 50 ºC y detección UV a 280 nm. En estas condiciones, la separación cromatográfica de los extractos proteicos se obtuvo en menos de 3 min. El método desarrollado permitió la selección de un pico ?marcador? para la determinación de proteínas de soja en productos cárnicos. Además, se comprobó que esta metodología era específica, precisa, exacta, robusta, y sensible siendo posible la detección y cuantificación de adiciones de ~ 0.08 % (m/m) y ~ 0.3 % (m/m), respectivamente, de proteínas de soja en productos cárnicos. La validación de las metodologías desarrolladas se realizó tanto para productos cárnicos crudos como procesados con diferente composición (elaborados con carnes de cerdo, pavo, pollo y ternera o mezclas de ellos) mostrando, además, que la presencia de proteínas lácteas en los productos cárnicos no interfería en la medida de las proteínas de soja. La cuantificación de las proteínas de soja en productos cárnicos procesados con calor comerciales y con diferente composición (elaborados con carnes de diferentes especies que podrían contener proteínas lácteas) se realizó utilizando un aislado de proteína de soja como patrón de proteínas de soja. Los resultados obtenidos mostraron que los contenidos en proteínas de soja determinados en productos cárnicos comerciales estaban dentro del límite establecido por la legislación española (3% de proteínas de soja referido a producto cárnico inicial). Con el objetivo de caracterizar los picos cromatográficos obtenidos con las metodologías desarrolladas para las proteínas de soja, se acopló la RP-HPLC de perfusión a un espectrómetro de masas para analizar, por primera vez, las proteínas de soja intactas en diferentes tipos de cultivos de soja. Las separaciones se realizaron en una columna de fase inversa de perfusión (100 x 2.1 mm d.i.) a un flujo de 0.5 mL/min, una temperatura de 60 ºC, y elución con un gradiente de 5 a 14 % B en 12 min, 14-16% B en 1 min, 16-20% B en 2 min, 20-28% B en 1 min, 28-40% en 8 min, 40-45% B en 2 min, y 45-95% B en 0.5 min. Las fases móviles A y B consistían en un 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético en agua y 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético en acetonitrilo, respectivamente. Se ha utilizado un procedimiento por pasos para optimizar los parámetros del espectrómetro de masas de trampa de iones con electronebulización que permitiera la detección más sensible. Se ha investigado la influencia que el potencial del capilar, el potencial de octapolo, el potencial de octapolo delta, el potencial a la salida del capilar y el potencial del skim tenían sobre la señal. Se ha elegido un potencial de capilar de 3 kV ya que permitía observar la mayor señal no observando ninguna mejora significativa al utilizar potenciales mayores. El potencial de octapolo seleccionado para la detección sensible de las proteínas de soja fue 4 V y el potencial de octapolo delta que mejores resultados mostraba fue 0.5 V. El menor potencial probado a la salida del capilar (50 V) fue el que resultó dar las respuestas más altas. Con respecto al potencial del skim, las respuestas más elevadas se observaron para valores intermedios seleccionando 45 kV. El análisis por RP-HPLC-ESI-MS de perfusión de los cultivos de soja mostró que el pico cromatográfico obtenido para los cultivos de soja al tiempo de retención del pico seleccionado como ?marcador? de las proteínas de soja en productos cánticos correspondía a las proteínas 11S de la soja. Además, de este trabajo se derivó una interesante aplicación. Se han investigado las similitudes y diferencias entre las habas de soja amarillas (las más habituales) y otras habas con diferente pigmentación (verde, rojo y negro) comercializadas como soja utilizando el método de RP-HPLC-ESI-MS de perfusión desarrollado. Además, también se han analizados habas rojas comercializadas como azuki idénticas a las habas rojas frecuentemente comercializadas como soja roja y fracciones proteicas (globulinas 11S y 7S) obtenidas por un procedimiento de fraccionamiento. Las habas con la misma coloración presentaban los mismos TIC, independientemente de que se hubieran adquirido como soja o no (azuki). Además, las habas amarillas presentaban un TIC muy diferente del observado para otras habas estudiadas (rojas, verdes o negras) con la excepción de un haba de soja negra. De hecho, algunos picos de las habas de soja amarilla fueron asignados a algunas proteínas características de la soja mientras que esta asignación no fue posible para las habas con otra coloración. El fraccionamiento de las principales proteínas de soja (globulinas 7S y 11S) se realizó para todas las habas estudiadas y su análisis por RP-HPLC-ESI-MS de perfusión permitió confirmar las diferencias encontradas entre las habas de soja amarillas y las habas con otra pigmentación. Una aplicación de interés derivada de este trabajo fue la diferenciación de soja de otros cultivos similares (azuki or mungbean). Finalmente, debido a las dificultades relacionadas en la caracterización del pico ?marcador? de las proteínas de soja en productos cárnicos mediante la utilización del método RP-HPLC-ESI-MS de perfusión propuesto, se desarrolló un nuevo método de cromatografía líquida multidimensional acoplada a espectrometría de masas en tándem. El aislamiento de los picos de interés a partir de extractos de aislado de proteína de soja (SPI) y de los productos cárnicos elaborados con SPI se realizó por RP-HPLC de perfusión. Tras la digestión enzimática con tripsina, las fracciones recogidas fueron analizadas por nanocromatografía de líquidos de alta eficacia- espectrometría de masas en tándem. Los resultados obtenidos permitieron la identificación de las proteínas de soja contenidas en el pico marcador que permitían la detección de adulteraciones de productos cárnicos con estas proteínas vegetales. Se identificaron diferentes subunidades de la glicinina A en el pico que permitía la discriminación entre productos cárnicos con y sin proteínas de soja. Entre estas, la subunidad A4 de la variedad G4 de la glicinina se encontró en todas las muestras. Consecuentemente, esta proteína (subunidad) puede ser utilizada como diana en nuevas tecnologías analíticas para la identificación de la adición de proteínas de soja a productos cárnicos.