Desarrollo de metodologías analíticas y estudios sobre la aplicabilidad de las proteínas de fase aguda como biomarcadores de salud y bienestar animal en el perro. Caracterización de itih4 como nueva proteína de fase aguda canina

Resumen

La concentración de proteínas de fase aguda (PFA) se eleva en el perro en diferentes situaciones patológicas. Aunque no es un parámetro que permita determinar la causa de la elevación y no pueden utilizarse como un test primario para la detección de una determinada enfermedad, estas proteínas presentan una elevada sensibilidad para la detección de situaciones que alteran la salud del animal y pueden proporcionar evidencia de que el animal presenta inflamación o infecciones subclínicas. Se han publicado numerosos estudios que describen las PFA como biomarcadores en diferentes tipos de enfermedades que afectan a la especie canina y el interés de su uso como biomarcadores de salud y bienestar animal ha ido incrementando en las últimas décadas. Sin embargo la falta de una metodología específica de especie adecuadamente validada se ha considerado como una de las principales limitaciones para la incorporación de estos parámetros en la clínica. El origen de esta tesis se encuentra en trabajos pioneros llevados a cabo en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular por el grupo del profesor Lampreave, que llevaron a cabo la caracterización de la respuesta de fase aguda en la especie porcina y el descubrimiento de la Pig-MAP, nueva proteína sérica y principal PFA en el cerdo, también conocida como ITIH4. Posteriormente se estudió la nueva proteína ITIH4 en otras especies como la humana, bovina y ovina donde también se comporta como una PFA positiva. En esta tesis se continúan estos estudios centrados en la especie canina. El objetivo general de este trabajo ha sido caracterizar la respuesta de la ITIH4, junto con otras PFA caninas ya conocidas (CRP, Hp y GPA) en diferentes procesos inflamatorios o enfermedades caninas. En este trabajo se ha aislado y caracterizado por primera vez la ITIH4 en la especie canina, que al igual que en el resto de las especies en las que se ha estudiado, consta de una única cadena polipeptídica de 120 KDa. Además se han purificado CRP, Hp y GPA con un alto grado de pureza. Las proteínas purificadas (ITIH4, CRP, Hp y GPA) se utilizaron para inmunizar conejos y obtener antisueros específicos que reconocían la proteína de interés. Los antisueros específicos se utilizaron para desarrollar y validar métodos analíticos robustos, que han permitido cuantificar cada una de estas proteínas en muestras de suero de perro. Se ha desarrollado un método de inmunodifusión radial (IR) y un ELISA tipo sándwich, que han permitido cuantificar por primera vez la ITIH4 canina en muestras de suero. A su vez, también se han desarrollado tres métodos de IR para la cuantificación de CRP, Hp y GPA caninas y un ELISA tipo sándwich para la Hp. La determinación de la concentración de ITIH4 canina, junto con el resto de PFA purificadas (CRP, Hp y GPA) en muestras de suero de animales sometidos a estímulos inflamatorios de diferente origen (cirugía, piometra, infección experimental con Leishmania infantum) ha permitido caracterizar a esta proteína como proteína de fase aguda moderada en la especie canina, tanto por el incremento que experimenta en su concentración tras los diferentes estímulos inflamatorios, como por la cinética mostrada tras la infección experimental con L. infantum. La toma de muestra en el tiempo inmediato tras la infección experimental con L. infantum ha permitido observar por primera vez una respuesta inflamatoria fuerte y temprana, caracterizada por un aumento de CRP, ITIH4 y Hp con valores máximos a las 24 -48 h, dependiendo de la PFA. Los valores de PFA volvieron a aumentar de forma mas moderada entre los 8 – 10 meses post-infección, coincidiendo en términos generales con la aparición de los síntomas clínicos. CRP e ITIH4 mostraron una correlación positiva y moderada con el título de anticuerpos anti Leishmania que presentaba el animal y también con la sintomatología clínica. La cuantificación de CRP, ITIH4, Hp y GPA en sueros de perros clínicamente sanos, ha permitido establecer un intervalo de referencia, para cada una de estas proteínas, para los métodos analíticos desarrollados. Adicionalmente se ha realizado un estudio en colaboración con la Asociación Española de Veterinarios Municipales (AVEM), que ha permitido evaluar el uso de estas PFA como marcadores de bienestar animal en perros alojados en centros de protección. En este estudio se ha encontrado una asociación de los niveles séricos de CRP y Hp presentes en animales alojados en centros de protección y las características de los diferentes centros estudiados, pudiendo asociarse niveles mas elevados de estas proteínas a características de los centros que pueden producir un menor estado de bienestar en el animal.