Diseño de diluyentes de congelación de semen porcino

Abstract

La criopreservación de semen es una biotecnología limitada en el ganado porcino. La sensibilidad del espermatozoide, especialmente de verraco, a los descensos de temperatura supone una serie de lesiones concentradas principalmente a nivel de la membrana plasmática y del acrosoma, desembocando en una disfunción celular, que se traduce en menores tasas de fertilidad y prolificidad cuando se aplica el semen congelado a estrategias de inseminación artificial. Los objetivos que en este estudio se plantean son: 1) Determinar la ratio óptima de espermatozoides por ovocito para las fertilizaciones in vitro de un macho seleccionado, 2) Evaluar el efecto de distintos azúcares en la composición del diluyente de congelación de semen porcino sobre parámetros seminales in vitro y capacidad de fertilización in vitro, 3) Evaluar el efecto de distintos antioxidantes adicionados al medio tradicional (LEY) sobre parámetros seminales in vitro y capacidad de fertilización in vitro, 4) Seleccionar los mejores diluyentes de congelación de semen porcino, variando el azúcar y la presencia o no de antioxidantes en los mismos, atendiendo a los parámetros seminales in vitro tras descongelación y validar los diluyentes seleccionados atendiendo a su capacidad de fertilización in vitro y así poder elegir el más eficiente en téminos generales. Para realizar nuestro estudio, las muestras de semen fueron obtenidas de un centro de inseminación y congeladas de acuerdo con el método de Westendorf y cols. (1975) posteriormente modificado (Carvajal y cols. 2004; Hernández y cols. 2007). El análisis seminal englobaba dos partes: contrastación seminal y fertilización in vitro. La contrastación seminal evaluaba una serie de parámetros rutinarios: motilidad total, motilidad progresiva, viabilidad, integridad acrosómica y reacción a endósmosis tras dencongelación (0, 1, 2 y 3 h). En lo que respecta a las pruebas de fertilización in vitro, los ovocitos fueron obtenidos de un matadero industrial, siendo madurados en el laboratorio e inseminados con semen congelado con los distintos diluyentes, para finalmente someterse a cultivo con el fin de valorar tanto parámetros de fertilidad como de desarrollo embrionario. En la primera experiencia, se realizó un estudio prospectivo para seleccionar un macho y a su vez determinar la ratio de espermatozoides:ovocito (1000:1, 2000:1, 4000:1) más efectiva para el mismo. Se congelaron un total de 39 eyaculados procedentes de distintos machos, revelando un efecto significativo en motilidad y motilidad progresiva tras descongelación, que resultó en una preselección de 16 machos. Estos verracos preseleccionados fueron sometidos a una selección más exhaustiva basándonos en los porcentajes de motilidad total, motilidad progresiva, viabilidad, integridad acrosómica, reacción a endósmosis y morfoanomalías. Los mejores resultados se obtuvieron con el macho 478dr. En cuanto a la ratio espermatozoides:ovocito, un total de 781 ovocitos fueron procesados. No se observó un efecto significativo sobre los parámetros de penetración, monospermia y eficiencia del sistema, destacando los resultados con la ratio 2000:1(49.1%, 95.2% y 34.3%, respectivamente). Este estudio preliminar nos permitió seleccionar el macho (478dr) para experiencias posteriores así como la ratio espermatozoides:ovocito (2000:1) más eficiente para el mismo en las fertilizaciones in vitro. En la segunda experiencia, se estudió el efecto de distintos azúcares (lactosa, trehalosa y glucosa) en la composición del diluyente de congelación seminal porcina, sobre los parámetros de calidad seminal in vitro y capacidad de fertilización in vitro. La calidad seminal se estudió en diez réplicas. Se reveló un efecto significativo sobre la integridad del acrosoma desde el momento de descongelación, que perduró hasta el final del periodo de incubación, alcanzando valores más elevados cuando la trehalosa estaba presente. Sin embargo, el efecto sobre motilidad, motilidad progresiva, viabilidad y endósmosis fue más evidente a finales de incubación. De acuerdo con las pruebas de fertilización, un total de 1690 ovoitos fueron procesados. En los resultados obtenidos se apreciaron diferencias en cuanto a las tasas de penetración, eficiencia y formación de blastocistos, alcanzándose los valores más elevado también en el grupo de la trehalosa. La tasa de división embrionaria no varió entre los grupos al igual que el número medio de células por blastocisto, aunque cabe destacar que fue con el diluyente de trehalosa donde se identificaron los blastocistos con mayor número de células. En la tercera experiencia, se estudió el efecto de la adición de distintos antioxidantes (cisteína, romero y la combinación de ambos) al diluyente de congelación de semen porcino LEY sobre los parámetros de calidad seminal in vitro y capacidad de fertilización in vitro. Como paso previo, se determinó la concentración de cisteína más efectiva. Para ello se llevaron a cabo cinco congelaciones en diluyente LEY suplementado con cisteína (0, 5 y 10 mM) y posteriormente las correspondientes contrastaciones. La concentración 10 mM fue elegida por su efecto beneficioso especialmente a nivel acrosomal. A continuación, la calidad seminal de los distintos grupos se estudió en diez réplicas. Se reveló un efecto significativo de la cisteína y romero, añadidos por separado, sobre la viabilidad e integridad acrosomal desde el momento de descongelación que perduró hasta el final del periodo de incubación. Sin embargo, solamente el romero ejercía una mejora significativa sobre la motilidad progresiva y las tasas de endósmosis positivas durante todo el proceso de incubación y a nivel de la motilidad total a las 3 h. De acuerdo con la pruebas de fertilización, un total de 2312 ovocitos fueron procesados. En los resultados obtenidos se apreciaron diferencias a favor del diluyente que contenía romero, en cuanto a los porcentajes de penetración y eficiencia, mientras que el porcentaje de penetrados monospérmicos no varió entre grupos. Atendiendo a la división embrionaria, se produjo un aumento significativo nuevamente en el grupo del romero. Sin embargo, no se apreciaron estas diferencias en los porcentajes de desarrollo embrionario hasta el estadío de blastocisto ni tampoco en el número medio de células por blastocisto formado. En la experiencia 4, para estudiar el efecto de doce diluyentes de congelación de semen difiriendo entre ellos en la combinación de dos factores, tipo de azúcar (lactosa, trehalosa y glucosa) y la presencia o no de antioxidantes (romero, cisteína y la combinación de ambos) sobre los parámetros seminales tras decongelación, se llevaron a cabo un total de diez congelaciones con sus respectivas contrastaciones. Según el diluyente utilizado en el proceso de criopreservación de semen, se produjo un efecto significativo sobre los parámetros globales obtenidos. Los mejores resultados se mostraron en el grupo que contenía trehalosa sola o en presencia de romero o de la combinación de romero y cisteína al mismo tiempo, acompañados también del diluyente con base de lactosa y esencias de romero. Estos cuatro diluyentes fueron los seleccionados para la última experiencia. En la quinta experiencia, para estudiar el efecto de los cuatro diluyentes seleccionados previamente, sobre los parámetros de fertilidad y desarrollo embrionario, un total de 2523 ovocitos fueron procesados. No se pudieron apreciar diferencias significativas en cuanto a las tasas de penetración, monospermia y eficiencia entre los distintos grupos, aunque la mayor eficiencia del sistema se observó en el diluyente de lactosa con esencias de romero. En cuanto al desarrollo embrionario, no existieron diferencias significativas entre grupos, aunque el diluyente que contenía trehalosa como azúcar y sin ningún tipo de suplementación, fue el que alcanzó mayores tasas de desarrollo hasta el estadío de blastocisto a la par que mayor número de células por blastocisto formado.