Terapia celular en la especie caninautilización de células madre adultas en el tratamiento de lesiones oculares

Resumen

Las lesiones oculares son patologías muy frecuentes en la especie canina. Aunque el ojo posee mecanismos propios de reparación, éstos se ven alterados en ocasiones, por lo que resulta de gran interés el desarrollo de terapias innovadoras que contribuyan al tratamiento de dichas patologías. La medicina regenerativa es un nuevo campo de la medicina que está consiguiendo resultados prometedores en el tratamiento de un amplio número de patologías en diferentes especies, incluida la especie canina. Las características de las células madre mesenquimales (MSCs) y las células madre limbares (LSCs) como son la autorenovación, diferenciación y capacidad inmunomoduladora pueden contribuir al tratamiento de las patologías oculares caninas consiguiendo la regeneración de tejidos que mantengan las propiedades del tejido original. En la presente Tesis Doctoral se ha propuesto llevar a cabo ensayos tanto in vitro como in vivo con el objetivo general de contribuir al desarrollo de tratamientos eficaces de lesiones oculares en la especie canina mediante la utilización de células madre tanto de origen mesodérmico derivadas de médula ósea (BM-MSCs) y tejido adiposo (Ad-MSCs) como de origen ectodérmico obtenidas de tejido limbar (LSCs). En primer lugar se ha realizado un ensayo que permita valorar el efecto de los métodos utilizados para la extracción y cultivo de las células sobre las características de las mismas. Se ha observado una alteración en los niveles de fragmentación de la cromatina de las células, alteración que disminuye y se estabiliza a lo largo de diferentes pases del cultivo. También se ha detectado una activación de los mecanismos de apoptosis, valorados mediante la ratio Bax/Bcl2 y de la expresión de caspasas efectoras, que mostraron sus mayores valores en los pases siguientes en los que se determinó una elevada fragmentación de la cromatina. Se han analizado las características de los tres tipos de células madre utilizadas. Los resultados mostraron que las Ad-MSCs exhiben una mayor tasa de proliferaron que BM-MSCs y LSCs. Los tres tipos celulares se han diferenciado a osteoblastos, adipocitos y condrocitos y han mostrado un perfil de expresión similar al descrito en las células madre de origen mesodérmico en la especie humana, observándose ciertas diferencias en los patrones de expresión entre los tres tipos celulares. Otra de las características estudiadas ha sido el potencial inmunosupresor que presentan estas células sobre la capacidad de proliferación de los linfocitos. Los tres tipos celulares mostraron un potente efecto inhibitorio en las ratios más elevadas de cocultivo siendo las LSCs las que presentaron un efecto mayor. Para la aplicación de las células al tratamiento de patologías oculares es necesario utilizar soportes adecuados, por ello se analizó el comportamiento de las células en dos tipos de soportes: lentes de contacto y membrana amniótica de origen equino. Debido a la falta de adhesión de las Ad-MSCs caninas, el análisis se llevó a cabo con BM-MSCs y LSCs. Las LSCs mostraron una mayor capacidad de adhesión y proliferación sobre la lente de contacto, sin embargo estás capacidades fueron mayores en el caso de las BM-MSCs cuando se cultivaron sobre membrana amniótica. Una vez realizados los ensayos in vitro que acabamos de comentar se llevó a cabo un ensayo in vivo que permitió el desarrollo de un modelo experimental de ulceración corneal en conejos. Se utilizaron 12 animales a los que se les provocó químicamente una deficiencia limbar y una ulceración en la córnea. Los animales se trataron con LSCs o Ad-MSCs cultivadas en lente de contacto y marcadas con bromodesoxiuridina (BrdU). Ambos tipos celulares fueron capaces de migrar desde la superficie de la lente hasta la lesión en el epitelio corneal y han mostrado ser capaces de regenerar el tejido lesionado siendo las LSCs las que mostraron un mayor potencial de migración y regeneración. Finalmente se han desarrollado dos ensayos in vivo que nos han permitido obtener resultados preliminares sobre el efecto terapéutico de las LSCs en el tratamiento de dos patologías oculares en perros: úlcera corneal indolente y queratoconjuntivitis seca (QCS). Para el tratamiento de ulceras corneales se han utilizado LSCs cultivadas sobre lentes de contacto. Se han tratado 5 pacientes que no habían mostrado respuesta a los tratamientos convencionales. Se ha conseguido restaurar la integridad de la córnea, la opacidad corneal así como reducir la neovacularización de la mayoría de los casos. Para el tratamiento de pacientes con queratoconjuntivitis (QCS) de origen inmunomediado, se han inoculado tres dosis de LSCs a nivel subconjuntival y en la glándula lagrimal accesoria. Los resultados preliminares obtenidos hasta el momento, aunque el ensayo está sin finalizar, muestran una mejoría a nivel clínico en los animales tratados y una respuesta positiva a nivel génico de los procesos involucrados en la patogenicidad de la QCS tanto a nivel de la composición acuosa de la lágrima, como de las mucinas presentes en la lágrima y la respuesta inmune.