Análisis funcional de las polifenol oxidasas (PPOs) de frutos de níspero (Eriobotrya japonica Lindl.)desarrollo y aplicación de herramientas moleculares y proteómicas

Résumé

La Polifenol Oxidasa (PPO) es la enzima responsable del pardeamiento enzimático en plantas, esta enzima produce la pérdida de calidad y del valor económico de muchas frutas y hortalizas frescas o procesadas. Para analizar el efecto de las PPOs en plantas, se han desarrollado numerosos estudios dedicados a la bioquímica y propiedades catalíticas de la enzima. Mediante Western blot, se ha observado la presencia de varias bandas de proteína de peso molecular de 55 a 66 kDa de frutos y hojas de diversas rosáceas (incluyendo el níspero). Por otra parte, el empleo de LC-MS/MS y secuenciación de novo, ha permitido obtener una amplia cobertura de secuencia. El alineamiento de péptidos con su proteína homóloga más similar reveló posiciones de aminoácidos divergentes que permitieron hacer una hipótesis del número mínimo de genes que codifican para las proteínas de níspero analizadas. Esto demuestra, que hay bases genéticas y evidencias experimentales que apoyan la existencia en diversas plantas de diferentes isoformas de PPO en el mismo tejido y en un mismo estadio de desarrollo, apuntando al desempeño de múltiples funciones. En ese trabajo, se hace una aproximación al problema de obtención de información precisa y confiable acerca del origen de una proteína perteneciente a una familia multigénica de especies poco representadas como es el caso de la PPO frutos de níspero. Para ello, nos hemos plateado desarrollar herramientas proteómicas y moleculares para analizar la implicación y función de la enzima PPO en el pardeamiento enzimático, un fenómeno ocasionado de forma natural o por daños mecánicos durante el desarrollo, sobremaduración y estrés en frutos de níspero de la Comunidad Valenciana. Como resultados de este trabajo, se ha puesto a punto un protocolo de aislamiento de RNA de alta calidad de frutos de níspero, y se ha revelado como un procedimiento de elevada eficiencia. El RNA aislado mediante este procedimiento puede ser aplicado para árboles frutales que contienen altos niveles de polisacáridos y compuestos polifenólicos, además, puede ser aplicable a otros tejidos como hojas, brotes, flores, raíces y tallos de níspero. Por otra parte, mediante la combinación de diversas estrategias moleculares, se han clonado fragmentos que contienen las secuencias codificantes completas y la región 3¿-UTR de tres genes parálogos Ej-PPO1, Ej-PPO2 y Ej-PPO3, que se expresan en el fruto de níspero. Ej-PPO1 contiene a la única secuencia parcial de PPO de níspero publicada, mientras que las otras dos no se habían descrito. La clonación a partir de DNA genómico demuestra la presencia de un intrón de 373 pb en Ej-PPO3 y la carencia de intrones en las otras dos. El descubrimiento de intrones de esta longitud en genes de PPO es un aspecto novedoso. El análisis de las secuencias predice la presencia de péptidos de direccionamiento al tilacoide en el extremo N-terminal, centros de unión de cobre, típicos de PPO y un posible sitio de palmitoilación en la región N-terminal de la proteína madura. El análisis espacio-temporal de la expresión de los tres genes parálogos de PPO de níspero analizados en esta tesis nos permite concluir que en el fruto en desarrollo estos genes muestran perfiles de expresión diferenciales en cualquiera de las situaciones fisiológicas estudiadas. Ej-PPO1 se expresa en fruto verde 40%, casi desaparece posteriormente y vuelve a remontar hasta alcanzar un máximo a siete días de sobremaduración. Ej-PPO2 tiene dos estadíos de expresión, fruto verde 40% y envero, mientras que en el resto prácticamente no se expresa. Ej-PPO3 solo se expresa a partir de recolección y se acumula especialmente durante la sobremaduración. En situaciones de estrés, Ej-PPO1 y Ej-PPO3 se expresan y lo hacen con perfiles muy similares entre si, tanto en postcosecha como en magullado, mientras que en esas situaciones de estrés, Ej-PPO2 no se expresa. Los tres genes muestran perfiles de expresión similares en distintos tejidos como brote, hoja joven y raíz pero ninguno se expresó en hoja madura, flor y tallo. Esta información sugiere que los tres genes pueden tener un papel protector en los tejidos jóvenes en desarrollo. En tejidos expuestos a situaciones de estrés, concretamente en la post-recolección 7 y 15 días, así como en brotes, hojas y raíz se observaron transcritos de un tamaño significativamente mayor al esperado que evidencia una transición en el programa de síntesis y/o maduración de estos mRNAs. Por otra parte, se han desarrollado métodos de proteómica dirigida de tipo MRM que permiten detectar y cuantificar de forma específica las tres isoformas de PPO en muestras sintéticas complejas con una respuesta lineal entre dos y tres órdenes de magnitud. El análisis de las muestras reales de PPOs de frutos de níspero combinando SDS-PAGE y MRM, condujo a la detección y cuantificación relativa de las isoformas Ej-PPO2 y Ej-PPO3, mientras que Ej-PPO2 se detectó en formas precursoras y maduras. En base a la presencia y patrón de abundancia relativa, la isoforma Ej-PPO2 parece ser la responsable del pardeamiento enzimático del fruto, cuando éste es sometido a condiciones de estrés por sobremaduración, almacenamiento post-cosecha y magullado.