Avances en metabolómica basados en la preparación de muestra en plataformas analíticas de cromatografía y espectrometría de masas

Resum

El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. Introducción o motivación de la tesis La finalidad de la investigación desarrollada fue, en primer lugar, obtener una información analítica lo más completa posible sobre desechos de la vid/olivo y de la industria vinícola y del aceite de oliva, que han suscitado poco o nulo interés hasta la fecha. En este caso las materias objeto de estudio han sido un residuo de residuo (el resultante de la obtención de etanol de los desechos vinícolas de las alcoholeras) y el alperujo (desecho de la producción de aceite de oliva por el sistema de dos fases). En segundo lugar se pretendió desarrollar una plataforma analítica para el análisis de aliento condensado de forma que se pudiera conocer su composición y características analíticas para comparar los perfiles obtenidos de personas afectadas por cáncer de pulmón y hallar un método de cribado que permitiera la detección precoz de la enfermedad. Los objetivos que motivaron la realización de la tesis fueron diferentes en función de la materia de estudio: -Conocer la situación actual descrita en la bibliografía de la explotación, real y potencial, de los residuos más destacables de la agricultura y la industria agroalimentaria mediterráneas (vid/vino y olivo/aceite). -Aportar nuevos conocimientos sobre la forma de obtención de compuestos de interés existentes en residuos de las industrias agroalimentarias más importantes de la comunidad andaluza (el vino y el aceite de oliva) con el fin último de potenciar el aprovechamiento de estos materiales de escaso o nulo valor. -Proporcionar un método para la determinación de los componentes del aliento condensado, de forma que este biofluido pueda utilizarse para el estudio de diversas enfermedades. 2. Contenido de la investigación El contenido de la investigación presentada ha implicado: -Conocer la situación actual descrita en la bibliografía de la explotación, real y potencial, de los residuos más destacables de la agricultura y la industria agroalimentaria mediterráneas (vid/vino y olivo/aceite); así como la consideración de la producción, composición fenólica y aplicaciones biomédicas de la uva. -Obtener compuestos de interés existentes en residuos de las industrias agroalimentarias más importantes de la comunidad andaluza (el vino y el aceite de oliva) demostrando que son potencialmente aprovechables. En todos los casos se han puesto a punto métodos de extracción de los compuestos de interés (mayoritariamente compuestos fenólicos). Se han utilizado los hollejos y pepitas desechados tras la obtención de etanol y se ha comprobado su capacidad antioxidante y caracterizado su composición. En el caso del alperujo la investigación estuvo orientada a los componentes minoritarios del aceite de oliva virgen (AOV), que confieren a este aceite sus características propiedades nutricionales y saludables, identificándolos y estableciendo sus patrones de fragmentación mediante espectrometría de masas en tándem. - Utilizar para la preparación de la muestra varias técnicas de extracción sólido-líquido asistidas por energías auxiliares, y como herramienta analítica principal y necesaria para la consecución de los resultados pretendidos un equipo constituido por un cromatógrafo de líquidos y un detector de masas de alta resolución. -Proporcionar un método para la determinación de los componentes del aliento condensado, identificar sus componentes, evaluar diferentes alternativas de normalización de los datos obtenidos para minimizar la influencia de fuentes de variabilidad externas, tales como el volumen de muestra proporcionado por paciente. -Discriminar en función de la composición de aliento exhalado entre pacientes con cáncer de pulmón, individuos con factor de riesgo e individuos sanos. Para el desarrollo de este estudio se utilizó de forma independiente el aliento condensado procedente de las vías respiratorias alta y baja. -Configurar paneles de compuestos potencialmente marcadores para el diagnóstico de cáncer de pulmón basados en la discriminación de pacientes afectados por esta enfermedad e individuos con factor de riesgo, esencialmente fumadores activos. La evaluación estadística de estos paneles permitirá seleccionar los paneles de mayor potencial en función de que su objetivo sea priorizar la sensibilidad, la especificidad o la combinación de ambos parámetros. -Identificar diferencias cualitativas y cuantitativas entre individuos fumadores, exfumadores y no fumadores en aliento condensado con el fin estudiar el origen de esos cambios: compuestos endógenos, exógenos o compuestos generados por el microbioma existente en las vías respiratorias. -Utilizar un cromatógrafo de gases conectado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC–TOF/MS) para el análisis del aliento condensado, teniendo en cuenta el carácter volátil o parcialmente volátil de los compuestos presentes en él, y la combinación de software y herramientas bioinformáticas para el tratamiento multivariante de los datos que permitan identificar compuestos potencialmente marcadores de un proceso biológico. 3. Conclusión La investigación ha permitido: • En el estudio de la uva y sus componentes ha permitido desarrollar metodologías para la caracterización de “residuos de residuos”, que resultan tras la destilación alcohólica del orujo de uva generado en la elaboración del vino, poniendo de manifiesto que: (i) El perfil de compuestos obtenido a partir de la misma materia prima resulta muy diferente en función del tipo de energía que se utilice para acelerar/mejorar la etapa de extracción. (ii) La extracción con líquidos sobrecalentados y el método convencional basado en maceración proporcionan un mayor número de compuestos en comparación con la extracción asistida por ultrasonidos o por microondas. (iii) La disminución del pH del extractante aumenta la eficacia de la extracción con líquidos sobrecalentados frente a la convencional, además de reducir significativamente el tiempo requerido (60 min en lugar de 24 h). (iv) Se extraen más compuestos polares que apolares como consecuencia tanto del extractante empleado como del alto contenido de compuestos polares en los residuos. (v) La variedad de compuestos tentativamente identificados en los extractos los convierte en potenciales aditivos en la industria alimentaria (ya sea como colorantes, como los modificadores del sabor o como antioxidantes), y también en las industrias de cosméticos y de nutracéuticos. (vi) Todo lo anterior permite concluir de este estudio que, a pesar de la degradación causada por las condiciones drásticas del proceso de destilación, existen muchos compuestos de interés en los extractos de los desechos de las alcoholeras, lo que los convierte en un material útil para un mejor uso que el de simple fuente de calor. • El desarrollo de la metodología más apropiada para la caracterización del alperujo, residuo generado tras la elaboración de aceite de oliva, demostrando que: (i) Los extractos obtenidos utilizando presión+temperatura altas contienen un gran número de fenoles (corroborado tanto con la medida de fenoles totales en el extracto por el método de Folin-Ciocalteu, como por el perfil fenólico obtenido mediante LC-QTOF). (ii) Los 49 compuestos identificados en estos extractos también se encuentran en el AOV. Entre ellos cabe destacar hidroxitirosol/tirosol y sus derivados, los precursores de iridoides, secoiridoides y sus derivados, flavonoides, lignanos y ácidos fenólicos. (iii) Se ha conseguido un extracto con alto valor añadido y un residuo sólido libre de antioxidantes que presenta unas características óptimas para la producción de gas, compost, etc., es decir, para cualquier tipo de aprovechamiento en el que la presencia de antioxidantes suponga un problema o una ralentización en la obtención del producto. • Las innovaciones desarrolladas en análisis global en el área clínica permiten concluir que: (i) Los biofluidos no convencionales como el aliento condensado deben considerarse en investigación clínica. Las ventajas del aliento condensado como muestra clínica están soportadas en su muestreo no invasivo y en su composición simple. (ii) El análisis de aliento condensado mediante GC–TOF/MS tras una simple extracción líquido-líquido posibilita la identificación de una amplia variedad de familias de metabolitos, lo que lo convierte en una opción muy adecuada para obtener una instantánea del metaboloma de este biofluido. (iii) La normalización basada en la suma total de la señal útil (MSTUS) es una opción muy apropiada para obtener una adecuada distribución de los datos además de una mínima variabilidad eliminando fuentes de variabilidad externa. (iv) La comparación de los metabolitos existentes en el aliento condensado de individuos sanos, con factor de riesgo y con cáncer de pulmón muestra las diferencias en el metabolismo de estos grupos, según el análisis llevado a cabo con la plataforma GC–TOF/MS. (v) Se ha constatado que la fracción inferior (vía respiratoria distal) del aliento condensado es la más adecuada para la discriminación entre individuos con cáncer de pulmón, con factor de riesgo e individuos sanos. (vi) Se han propuesto tres paneles de marcadores para la predicción del cáncer de pulmón que se caracterizan por una sensibilidad superior al 77.9% y una especificidad mayor del 67.5%, así como por un área bajo la curva superior al 77.5 %. Dos compuestos de estos paneles corresponden a la ruta de degradación del tolueno, uno de los componentes del tabaco. (vii) Se han identificado seis compuestos directamente relacionados con el tabaco que se encuentran a mayor concentración en individuos con cáncer que en individuos con riesgo de padecerlo o en individuos sanos. (viii) Se han identificado 12 compuestos significativos en la comparación del perfil del aliento condensado de fumadores y no fumadores, y 6 en la comparación de exfumadores y fumadores. En ambos tests estadísticos aparece un compuesto fenólico, el 2,4,6-triisopropylfenol y un alcohol graso, el undecanol. Además, en la primera comparación cabe destacar el indol, un derivado de ácido graso (monoestearina) y dos compuestos fenólicos tales como el p-cresol, y el 2,6-bis (1,1-dimetiletil) -4- (1-metil-1-feniletil) fenol. En la segunda comparación alcanfor, heptadecynol, escualeno y un derivado fenólico, el ácido benzoico-4-etoxi-etiléster. (ix) Se ha relacionado el cambio significativo en concentración de ciertos compuestos con la alteración del microbioma de las vías respiratorias causada por el hábito de fumar. La alteración tiene una incidencia directa en la respuesta inmune afectando a la producción de metabolitos con propiedades anti-inflamatorias y antimicrobianas.