Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares en especies del género candida

Resumen

Se ha desarrollado un método de obtención de exosomas, a partir de cultivos de levaduras del género Candida, que ha permitido obtener microvesículas de elevada homogeneidad y pureza. Mediante microscopía electrónica de transmisión y técnicas de detección de nanopartículas (NTA), se ha podido constatar la presencia de microvesículas de tamaños comprendidos entre 100 y 200 nm. La caracterización de proteínas llevada a cabo por técnicas de Western blot, ha puesto de manifiesto la elevada pureza de los exosomas obtenidos, no existiendo contaminación celular en las preparaciones, tal y como lo indican el resultado positivo frente a calnexina en el lisado celular y negativo en las vesículas extracelulares; positivo frente a enolasa en las vesículas extracelulares y negativo en el sobrenadante de ultracentrifugación; positivo frente a las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81, en las microvesículas y negativo en el lisado celular; positivo frente Hsp70, tanto en microvesículas como en el sobrenadante de ultracentrifugación y positivo, con elevada polidispersión frente a anticuerpos anti-pared, en las microvesículas. El tratamiento con Concanavalina A-ferritina, ha permitido detectar la presencia de manoproteínas en las microvesículas aisladas. El análisis proteómico, ha permitido identificar un elevado número de proteínas en los exosomas de las cuatro cepas analizadas, C. albicans SC5314 a 37ºC, C. albicans SC5314 a 28ºc y los mutantes glx3 y pir1, ambos crecidos a 28ºC, alcanzando un total de 985. De ellas, tan solo 181 se encuentran en los exosomas de C. albicans SC5314 a 37ºC, aumentando hasta 350 cuando se crece a 28ºC y hasta las 932 en el caso del mutante pir1, lo que pone en evidencia la influencia del estrés térmico y de la alteración de las proteínas estructurales de pared que el mutante presenta, lo que provoca una mayor permeabilidad de la misma, facilitando la salida al exterior de las microvesículas. Del conjunto de proteínas identificadas en la composición de los exosomas purificados, tan solo 158 (el 16,0 %) son comunes a las tres cepas crecidas a 28ºC (SC5314 y mutantes glx3 y piry consideramos que estas son fundamentales para la producción y secreción de las vesículas extracelulares, ya que en ellas se incluyen las funciones de lisis, que mediante la hidrólisis de polisacáridos y manoproteínas, permitirán remodelar la estructura de la pared, lo que facilita la salida de las microvesículas al exterior, recuperando posteriormente la integridad de la pared celular. Mecanismo que ha podido ser confirmado mediante microscopía electrónica de transmisión. Se han detectado y secuenciado 34 miRNA, 32 de los cuales son específicos de C. albicans y 2 de ellos, además, poseen total homología con humanos. Todos los miRNA están ubicados en regiones intergénicas. El análisis de las funciones de los genes flanqueantes, sobre los que podrían ejercer algún posible mecanismo de regulación de la expresión génica, pone de manifiesto que, en su mayor parte, poseen funciones de respiración y también relacionadas con la formación de biopelículas y con tRNA mitocondrial. De los dos miRNA que presentan homología completa con humanos, uno de ellos está relacionado con el aumento de la población de células madre en carcinomas de colon y un pronóstico desfavorable en los casos de cáncer gástrico, mientras que el otro, está considerado como diana molecular para prevenir el cáncer esofágico y como un posible biomarcador en el carcinoma colo-rectal. Los análisis realizados en exosomas purificados de levaduras del género Candida, indican que su génesis y secreción, requieren de la intervención de un gran número de proteínas, por lo que las microvesículas extracelulares podrían ser consideradas como una plataforma antigénica que serviría de punto de partida en la preparación de nuevas vacunas. Además, dicho mecanismo podría ser tenido en cuenta en el diseño de nuevos fármacos antifúngicos, al producirse, en el proceso de secreción, una significativa remodelación de la estructura de la pared celular de la levadura que la haría más vulnerable.