Carcinoma escamoso de esófagoestudio de la expresión de la oncoproteína ganquirina como factor oncogénico y su importancia clínico-patológica

Resumen

Ganquirina es una oncoproteína que consiste en siete repeticiones de anquirina, localizandose en el cromosoma Xq22.3. Se encuentra sobre-expresada en la regeneración hepática y fallo hepático fulminante y en la mayoría de los carcinomas hepatocelulares demostrando que a mayor sobreexpresión peor pronóstico de supervivencia. A nivel celular la ganquirina se une a retinoblastoma (Rb) y a la subunidad S6 ATPasa de el proteosoma, y aumenta la degradación de Rb. Ganquirina se une a Mdm2, facilitando el enlace p53-Mdm2 incrementando la degradación de p53, además la ganquirina se une a CDK4 e inhibe la supresión tumoral, acelerando la progresión del ciclo celular. El objetivo de esta tesis doctoral fue determinar el papel de la oncoproteína ganquirina en el carcinoma escamoso de esófago humano y evaluar su significancia clínico-patológica. La determinación y comparación de la expresión de ganquirina en diferentes líneas celulares de CEE y línea celular de epitelio esofágico normal; valoración de los cambios en el crecimiento celular, ciclo celular, migración e invasión celular tumoral in vitro y formación tumoral in vivo, tras la inhibición de ganquirina por silenciamiento genético (vector shRNA). La expresión de ganquirina se evaluó en 11 líneas celulares de carcinoma escamoso de esófago (Serie KYSE) mediante RT-PCR y Western Blot, comparándolas con línea celular de epitelio esofágico normal (NEK2) y HeLa. Se realizó una inhibición estable de la expresión de ganquirina mediante transfección génica (shRNA) analizando crecimiento celular, ciclo celular por citometría de flujo y migración e invasión celular in vitro y formación tumoral subcutánea en ratones desnudos. Clinicopatologicamente la expresión de ganquirina se evaluó en 133 pacientes portadores de carcinoma escamoso de esófago sometidos a esofaguectomía. 30 de ellos evaluados mediante Real Time RT-PCR y 103 de ellos evaluados mediante tinción inmunohistoquímica. La expresión de ganquirina estaba sobre-expresada en las 11 líneas celulares de carcinoma escamoso de esófago comparadas con la línea celular de epitelio esofágico normal. Tras la inserción de un RNA de interferencia específico para ganquirina, se observó una inhibición estable de la expresión de esta oncoproteína en las células de la línea celular de carcinoma escamoso de esófago humano KYSE 170 y los subclones derivados 170G1 y 170G2. Subclones de la misma línea celular insertados con vector vacío (KYSE 170 mock) no presentaron inhibición. Las células cultivadas procedentes de los subclones con amplia inhibición estable de ganquirina (KYSE 170G1 y 170G2) presentaron escasas mitosis en cultivo, detención del ciclo celular en fase G1/S evaluado con citometría de flujo, así como una disminución de la capacidad de migración e invasión celular tumoral evaluada con cámaras de microporos con y sin matrigel respectivamente. La inoculación de células cultivadas KYSE 170G1 y 170G2 con inhibición estable de ganquirina en ratones nude, mostró una reducción significativa de más de un 85% del tamaño tumoral comparada con la inoculación de células con vector vacío y sin inhibición (KYSE 170 mock y 170 wild). El análisis inmunohistoquímico de los tumores obtenidos a partir de células inhibidas, confirmó la ausencia de la expresión de la proteína ganquirina. La expresión de ganquirina fue estudiada también sobre material biopsico procedente de 133 pacientes con carcinoma escamoso de esófago sometidos a esofaguectomía quirúrgica total y sub-total. En todos ellos existió un significativo aumento de la expresión de ganquirina en el tejido tumoral con respecto al tejido no tumoral estudiada tanto por Real Time-PCR (30 pacientes) o por inmunohistoquímica en tejido en parafina (103 pacientes). Clinicopatologicamente en los 103 tumores estudiados inmunohistoquímicamente la hiperexpresión de ganquirina se correlacionó estadísticamente con el tamaño tumoral (T), metástasis ganglionares (N), metástasis a distancia (M), estadio tumoral (TNM) y una menor supervivencia de los pacientes, mostrándose además como un factor de mal pronóstico independiente en el carcinoma escamoso de esófago.