Desarrollo de un test molecular para la deteccion y cuantificacion de celulas de melanoma en micrometastasis y sangre periferica, mediante el analisis del mrna de la tirosinasa por rt-pcr y empleo de un secuenciador automatico

Resumen

En este trabajo hemos ideado y desarrollado un método propio capaz de detectar y cuantificar la presencia del RNA mensajero de la tirosinasa en sangre venosa periférica y ganglios linfáticos de pacientes afectos de melanoma maligno, mediante transcripción reversa y una única PCR de 45 ciclos en un solo tubo, evitando muchos de los inconvenientes de la denominada "nested" PCR. El análisis cuantitativo se realizó con ayuda de una molécula mutante de RNA ("standard HTYR RNA") generada mediante transcripción in vitro de un fragmento de cDNA del gen de la tirosinasa obtenido por RT-PCR y mutagénesis dirigida. Así mismo, dicho "standard" resultó de utilidad en el control de posible contaminación de las muestras de PCR. La aplicación de esta técnica en la detección de células circulantes de melanoma permite la identificación de un grupo de pacientes con un elevado riesgo de progresión de su enfermedad desde estadios iniciales y se ha mostrado relacionada con un peor pronóstico de los pacientes pertenecientes a los estadios avanzados de la enfermedad.