Determinación de Streptococcus Mutans y Streptococcus Sobrinus, mediante pcr cuantitativa a tiempo real, y su relación con la caries dental en escolares de la Comunidad Valenciana

Resum

La caries dental presenta una etiología multifactorial, los factores ambientales, los hábitos de alimentación, higiene bucal y la susceptibilidad genética individual, juegan un papel importante en el desarrollo de esta enfermedad (1). Los Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus están fuertemente implicados en la aparición de la caries dental en humanos. Numerosos estudios han demostrado que la asociación de S. mutans y S. sobrinus conlleva niveles más altos de caries (2-4) y varios estudios han encontrado que la prevalencia deS. sobrinus está fuertemente asociada con mayor actividad de caries que la delS. mutans (5-6). Se considera que la determinación de estas dos especies en la infancia podría ser importante para el diagnóstico y prevención de la caries dental. Algunos autores (7-8) han desarrollado métodos de PCR para la detección de S. mutans en muestras de placa dental. Para facilitar la recogida de muestras biológicas para estudios epidemiológicos, se ha desarrollado un método PCR para detectar S. mutans y S. sobrinus en saliva, usando las primers específicos para los genes que codifican la glucosiltransferasa (gtfB en S. mutans) y (gtfI en S. sobrinus), que puede utilizarse para evaluar la prevalencia de estos organismos en los estudios epidemiológicos (9). Basándose en una fuerte correlación entre el recuento de microorganismos en la saliva y placa, la determinación de S. mutans en la saliva se ha sugerido como un método adecuado para identificar pacientes con alto riesgo de caries dental (10). Como la saliva está continuamente en contacto con todos los dientes, proporciona un mejor reflejo de la colonización de Estreptococos mutans en toda la dentición (11). Los objetivos de este estudio fueron determinar la prevalencia de S. mutansy S. sobrinusy de la asociación de S. mutans y S. sobrinus en niños de 12 y 15 años de edad,de la población infantil de la región de Valencia (España), empleando un método PCR cuantitativa, en muestras de saliva y examinar a la relación de estas bacterias con la prevalencia de caries y el Índice CAOD. MATERIAL Y MÉTODOS Grupo de estudio Se realizó un estudio epidemiológico transversal, con una muestra aleatoria de una población de niños de 6, 12 y 15 años de edad, en la Comunidad Valenciana, España. La población infantil de la Comunidad Valenciana cuenta con 45.000 niños, que asisten a más de 1.500escuelas primarias y secundarias de la región. Se realizó muestreo al azar de conglomerados (aulas en las escuelas),Se seleccionaron 9 colegios de la provincia de Castellón, 16 de Alicante y 35 de Valencia(12). De la población examinada, sólo se recolectaron muestras de saliva de los niños cuyos padres firmaron un formulario de consentimiento informado, resultando un tamaño de muestra final para este estudio de 280 de 6 años, 303 niños a la edad de 12 y 311 de 15 años. Exploración Clínica Para asegurar la fiabilidad de las mediciones, la calibración en el diagnóstico de caries, de los 6 dentistas reclutados para el estudio, se llevó a cabo durante las semanas previas al comienzo del mismo. Los tres dentistas con el mayor acuerdo, evaluado mediante el índice Kappa, con un examinador experimentado, patrón estándar, fueron nombrados como examinadores. Los valores Kappa para las comparaciones de cada examinador con el patrón estándar eran 0,91 y 0,86 0,85, respectivamente, para cada uno de ellos. Los exámenes clínicos fueron realizados en las escuelas, con el niño sentado en una silla, usando una lámpara portátil de 60 W y espectro blanco–azul como la fuente de iluminación. No más de 25 niños fueron examinados durante una sesión para evitar los efectos del cansancio visual. Los instrumentos de examen empleados fueron una sonda periodontal tipo WHO y un espejo de boca plano del Nº 5. Cada pareja de examen disponía de 35 equipos de sondas estériles y espejos, cada uno en una bolsa sellada, colocados en un recipiente de plástico portátil. El trabajo de campo se llevó a cabo durante noviembre y diciembre del 2004. Cuestionario-test Para recolectar información sobre las conductas relacionadas con la salud oral, se pidió los niños, de 12 y 15 años de edad, el completar un cuestionario escrito. El cuestionario consistió en preguntas con respuestas de opción múltiple que ya habían sido utilizadas y validadas en otros estudios en España (12). En las preguntas que se incluyeron las solicitud de información sobre la frecuencia de cepillado de dientes y la frecuencia de la ingesta de alimentos cariogénicos. Los enjuagues de fluoruro en la escuela,que se hacían una vez a la semana, también se registraron. Variables Los criterios de caries de la OMS (13) fueron empleados para el diagnóstico y codificación de todos los dientes examinados. De todos los datos recogidos en los distintos formularios empleados se utilizan las siguientes variables: - Índice CAO (D). - Componente C de ICAO (D). - Índice co (d). - Componente c del Ico (d). - Prevalencia de caries ICAO (D)>0. - Prevalencia de caries Ico (d)>0. - Clase social. - Cepillado dental. - Enjuagues de Flúor. - Ingesta de alimentos cariogénicos entre comidas. - Presencia de S.mutans. - Presencia de S. Sobrinus. - Presencia de la asociación S. mutans-S. sobrinus. - Ausencia de S. mutans y S. sobrinus. El cumplimiento de los programas enjuagues de boca en las escuelas, se registró como alto, si el enjuague semanal con fluoruro, por parte de los escolares,se había realizado durante al menos un año académico antes de los exámenes. De no ser así, era consideradobajo. La ingesta de alimentos cariogénicos se consideró alta, si los alimentos cariogénicos(alimentos con un alto contenido de azúcar refinado) fueron ingeridos entre las comidas cada día o casi todos los días. De lo contrario la ingesta de alimentos cariogénicos era considerada baja. Finalmente, el hábito de cepillado diario se registró como apropiado si el niño informó cepillarse sus dientes por lo menos una vez al día, de lo contrario era considerado inadecuado. Muestras Saliva La saliva fue recopilada con una punta de papel estéril no.50, manejada con pinza estéril y colocada en la punta de la lengua del niño, durante 1 minuto para que sé empape con saliva. Cada punta fue trasladada con las pinzas a un tubo Eppendorf estéril. Los tubos fueron transportados en un refrigerador portátil, para guardar en un congelador donde se almacenaron a -20ºC. Ninguno de los tiempos de viaje superó 3-4 horas. Aislamiento del DNA del S. mutans y S. sobrinus de muestras de la saliva El aislamiento y purificación de ADN genómico se realizó con el ChargeSwitchForensic DNA PurifikationKit (Invitrogen). (Invitrogen Corporation 1600 Faraday Avenue Carlsbad, California 92008) PCR Cuantitativa Cálculo del número de copias Las curvas estándar se obtuvieron utilizando las cepas bacterianas S. mutans (CCUG 11877T, serotipo c; Clarke 1924-AL) y S. sobrinus (CCUG 27507, serotipo d; Coykendall 1983-VP). Las cepas bacterianas fueron cultivadas en placas de agar sangre y luego sometido a suspensión 0,5 de McFarland (equivalente a 1.5 x 108 UFC/ml). Se realizaron diluciones seriadas para obtener suspensiones bacterianas de 1 x 100 a 1 x 107 CFU. La detección cuantitativa de S. mutans y S. sobrinus se realizó mediante el ensayo de TaqMan (14). Brevemente, pares de primers gen-específicos (200 nM) y sondas (250 nM) para S. mutans y S. sobrinus fueron utilizados con 1 X TaqMan Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems) y 5 µl de ADN bacteriano aislado en el volumen de reacción de 20 µl. Las condiciones PCR fueron 10 min a 95 º C para la activación de la enzima, seguida por 45 ciclos de dos etapas (15 sec 95 º C, 1 min a 58 º C). La detección se realizó mediante el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7900. Curvas estándar para cada organismo se obtuvieron de la amplificación del ADN genómico de las muestras que contienen 1.0 x 100 a 1.0 x 107 CFU. Cada muestra se analizó por triplicado y el valor de Ct de cada muestra fue convertido a la cantidad de S. mutans y S. sobrinus utilizando las curvas estándar de medida en el mismo experimento. La linealidad y la sensibilidad del ensayo se determinaron de estas curvas estándar por qPCR. La detección y cuantificación fue lineal en un rango de 1.0 x 102 y 1.0 x 107 CFU por la mezcla de reacción para S. mutans y S. sobrinus. Este análisis fue utilizado para determinar la cantidad de S. mutans y S. sobrinus de 303 niños de 12 y 311 de 15 años de edad. Análisis estadístico Los datos fueron analizados con la aplicación de la estadística SPSS 19.0. Las muestras fueron divididas en cuatro grupos respecto de ser portador de Streptococcus: libre de estreptococos, llevando sólo S. mutans, llevando sólo S. sobrinuso llevar una asociación de S. mutans-S. sobrinus. Se realizó un análisis bivariante para comparar los valores promedio de CAOD usando la prueba ANOVA o prueba t de Student. Se utilizó una prueba de Chi cuadrado para probar las diferencias en la prevalencia de caries. Se realizó un análisis de regresión logística con la prevalencia de caries como variable dependiente y las variables: libre de estreptococos, portador solo S. mutans, portador solo S. sobrinus, portador de la asociación de S. mutans-S. sobrinus, cepillado diario de dientes, ingesta de alimentos cariogénicos, realización de enjuagues de flúor y la edad como variablesindependientes. RESULTADOS Se realizó un estudio transversal para determinar la prevalencia de Streptococcusmutans y Streptococcussobrinus y la asociación de los dos, en una muestra aleatoria (n = 894) de la población infantil de la región de Valencia (España). Se analizaron muestras de saliva, por el método de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) cuantitativa, para estudiar la relación de estas bacterias con la prevalencia de caries y el Índice CAOD. La prevalencia de S. mutansfue de 38,2% en la edad de 6 años, 35,4% en la edad de 12 años y 22,9% en la de 15 años. La prevalencia deS. sobrinuses de 20,3% a los 6 años 18,9% a los 12 años y 8,4% a los 15 años. La asociación de los S. mutans-S. sobrinuses 18,3% a los 6 años, 18.2% y 6,8% a los 12 y 15 años respectivamente. A los 6, a los 12 y 15 años de edad, las tasas de prevalencia de caries fueron inferiores en el grupo de niños libres de Streptococcus (29,9%, 37,6% y 48,5% respectivamente) y mayor en el grupo sólo S.mutans (42,9%, 67,3% y 74.0). A los 6 años de edad tanto la prevalencia de caries en dentición temporal como el índice cod existen diferencias significativas entre los diferentes grupos. La prevalencia de caries es mayor en los grupos solo S. mutans y solo S. sobrinus respecto a los libres de Streptococos y a la asociación. El grupo solo S. mutans presenta un índice cod significativamente mayor que el resto de grupos. A los 12 años existen diferencias significativas entre los 4 grupos estudiados tanto en la prevalencia de caries en dentición permanente, como en el ICAO(D) y su componente C. El grupo solo S. mutans es el que presenta cifras más elevadas. A los 15 años existen diferencias significativas entre los grupos en la prevalencias de caries en permanentes, en el ICAO(D) y en el componente C. El grupo asociación S.Mutans-S. Sobrinus y el grupo solo S. Mutans, muestran las cifras más altas. La concentración en saliva de S. mutans ha sido de 6.36x104 UFC/ml (3.93x104-8.78x104) a los 6 años, de 6.47x104 UFC/ml (1.81x103-1.28x105) a los 12 años de edad y de 2.11x104 (5.95x103-3.63x104) a los 15 años. En cuanto a los niveles de S. sobrinus fueron de 5.50x104 UFC/ml (3.33x104-7.66x104), de 1.44x104 UFC/ml (3.04x103-2.56x104) y 1.36x103 UFC/ml (0-2x103) respectivamente. DISCUSIÓN La etiología de la caries es de carácter multifactorial, compuesta por factores genéticos, conductuales, ambientales y microbianos (15). La caries es una infección polimicrobiana (16). Cada especie bacteriana desempeña un papel en la determinación de la cariogenicidaddel biofilm o placa dental. En este estudio hemos analizado muestras de saliva sin estimular, para determinar la presencia de S. mutans y S. sobrinus y relacionarla con la presencia o ausencia de caries, en niños en edad escolar, en la Comunidad Valenciana. El sistema que empleamos para detectar S. mutans, en muestras de saliva sin estimular, mediante una reacción en cadena de polimerasa (qRT-PCR), se ha utilizado en otros estudios y ha demostrado ser válido y fiable (14), aunque las limitaciones de los estudios transversales para el establecimiento de asociaciones entre microorganismos y caries dental no deben ser olvidada (17). La determinación de niveles de UFC/ml deS. mutans y S. sobrinus, por PCR cuantitativa en tiempo real, ha demostrado ser un método fiable y rápido que es aplicable en los estudios epidemiológicos (4,9). S. mutansy S. sobrinus son las especies que han sidoaisladas más frecuentemente de la cavidad oral humana e implicados como los principales gérmenes que causan caries dental en los seres humanos (18). Hay estudios que han demostrado que la presencia de S. sobrinus se asocia con una mayor actividad de caries (19). S. mutans es la especie predominante y es a veces el único aislado. En el presente estudio, al igual que en otros (20), cuando se aisló S. sobrinus elS. mutanscasi siempre está presente también. Los resultados de este estudio muestran prevalencias de S. mutansde 38,2% a los 6 años, de 36% en la edad 12 y de24,5% en la edad 15 años, el S. sobrinus tiene una prevalencia de 20,3%, 18,9% y 8,4% y la asociación S. mutans-S. sobrinus prevalencias de 18,2%,18.2% y 6,8% respectivamente. Estas cifras son muy inferiores a los obtenidos en otros estudios, que abarcanprevalencias de 51% a 100% de S. mutans y de 23% a 83% para S. sobrinus (2-3, 21-23). Existen varias explicaciones para la baja prevalencia de Streptococcusmutans y S. sobrinus. En primer lugar, los estudios epidemiológicos publicados con las determinaciones en la saliva de S. mutans y S. sobrinus por la técnica qPCR, se basan en un bajo número de muestras, que van desde 80 (4) a 140 muestras (11), en comparación con 894 muestras en el presente estudio. Otro punto importante es que la población infantil de la región de Valencia, donde se obtuvo la muestra representativa al azar, se caracteriza por niveles bajos de caries, acceso a programas públicos de selladores de fisuras, enjuagues de fluoruro en las escuelas y un alto porcentaje de cepillado, que podría influir en la baja prevalencia. Un último punto que debe considerarse al evaluar los datos es que nuestro estudio se basó en muestras de saliva en reposo, en lugar de saliva estimulada, y podría ser que estimulando la saliva con parafina, un procedimiento usado en otros estudios, removamos el biofilm bacteriano que se adhiere a la superficie del esmalte, llevando así un mayor número de bacterias a la saliva. Aunque la recogida de las muestras de saliva de la lengua puede sesgar los resultados, hay estudios que han encontrado una relación entre las cantidades de S. mutans en la placa y la saliva, así que si un gran número de gérmenes son encontrados en la saliva, el número de la placa también será alto (24-25). En cuanto a la relación entre S. mutans y caries dental, encontramos significativamente mayor prevalencia de caries en los portadores deS. mutans en ambos grupos de niños. También encontramos una relación positiva entre la prevalencia de S. mutans y el índice CAOD, como lo hicieron otros (26). Con respecto a la Asociación de S. mutans-S. sobrinus, en el presente estudio los niños de 15 años con esta asociación exhibieron mayor recuentos delíndice CAOD, similares a los encontrados en otros estudios que demuestran que la asociación de estas dos bacterias está relacionada con niveles más altos de caries (2-4). Sin embargo, en el presente estudio no se encontró esta asociación en el grupo de 6 ó12 años de edad o en el análisis de la muestra en su conjunto. Los estudios longitudinales indican que los niños portadores de ambos S. mutans y S.sobrinustienen una incidencia significativamente mayor de caries dental que aquellos que son portadoressolo deS. mutans(3). Con el fin de establecer la relación entre la caries y la presencia de ciertas bacterias, debe tenerse en cuenta que las lesiones de caries pasan por varias etapas según su profundidad y que esto influirá en la presencia y el predominio de determinados microorganismos y la disminución o ausencia de los demás (27). Una revisión sistemática de la literatura (28) confirma que S. mutans desempeña un papel importante en la iniciación de la caries del esmalte y raíz. Sin embargo, algunos estudios recientes indican que la relación entre S. mutans y las caries no es absoluta: altas cifras de S. mutans pueden persistir en las superficies dentales sinque ocurran lesiones y al contrario se pueden desarrollar caries en ausencia de esta especie (29). La caries se produce como resultado de una compleja interacción entre la placa dental (cuyas características fisiológicas pueden ser modificados por los carbohidratos en la dieta), la dieta y las prácticas de higiene oral. Estas interacciones son difíciles de entender, especialmente cuando nuestro conocimiento de la microflora asociada a la salud, la enfermedad y la transición de salud a la enfermedad es muy limitado (30). En un análisis de regresión logística múltiple con prevalencia de caries como variable dependiente, losS. mutans, ingesta de alimentoscariogénicos y la edad han demostrado ser importantes variables independientes significativas. Nuestros resultados sugieren una asociación clara entre la caries y la presencia de Streptococccusmutans pero no confirman una relación entre la caries y la asociación S. mutans-S. sobrinus. En poblaciones con niveles bajos de caries, la prevalencia de S. mutans y S. sobrinus en saliva sin estimular no es tan alta como se podría esperar. Su determinación en los estudios epidemiológicos puede proporcionar información valiosa para la evaluación del riesgo de caries, aunque no se debe olvidar la naturaleza multifactorial de esta enfermedad.