Expresión génica diferencial y mapa de destino de prosencéfalo, el área paraneural rostral y la adenohipófisis en estadios de placa neural del embrión pollo

Resum

Los procesos del desarrollo relacionados con la gastrulación temprana permiten la formación de las tres capas germinales fundamentales: el ectodermo, el mesodermo y el endodermo (Lemaire y Kessel 1997; Sheng y col., 2003). La inducción neural en embriones de pollo comienza durante los estadios de gastrulación, HH3, antes de que la línea primitiva alcance su máxima longitud y el mesodermo axial comienza a ser producido (Dias y Schoenwolf, 1990; Storey y col., 1992). El proceso de inducción neural es modulado espacialmente por una red compleja de señales planares y verticales (Ruiz i Altaba, 1993; Pera y col 1999; Linker y Stern, 2004). En los estadios iniciales, la inducción neural ectodérmica tiene un carácter principalmente anterior (prospectivo prosencéfalo). En estadios posteriores, las señales desde el nódulo de Hensen (Hensen 1876) y sus derivados mesodérmicos axiales transforman las partes caudales del ectodermo a destinos posteriores (Nieuwkoop y col., 1952; Nieuwkoop y Nigtevecht 1954; Foley y col., 2000; Foley y Stern, 2001). Una vez establecida, la placa neural anterior gradualmente se vuelve regionalizada en dominios que generaran posteriormente las regiones del telencéfalo, óptica, hipotálamo y diencéfalo (para estas particiones utilizamos el modelo prosomérico; Puelles y Rubenstein, 2003). Los procesos moleculares y celulares requeridos para tal especificación diferencial de la placa neural anterior no son bien entendidos, aunque recientes estudios en pez cebra han arrojado luz al respecto (Hashimoto y col., 2000; Scholpp y col., 2003; Wilson y Houart., 2004; Seiliez y col., 2006; Cavodeassi y col., 2005; Colombo y col., 2006; Staud y Houart 2007). Los estudios sobre la diferenciación molecular realizados en embriones de pollo en estadios HH8/14 sugieren que los limites de expresión de los genes en el prosencéfalo temprano son altamente dinámicos, y un campo prosencefálico uniforme se desarrolla antes de la regionalización anteroposterior y dorsoventral (Bell y col., 2001; Kiecker y Lumsden, 2005). En los estadios de placa neural temprana, los datos disponibles principalmente afectan a los mapas espaciales y cronológicos de los marcadores neurales y no neurales brevemente después de que la inducción neural ocurra (Streit y Stern, 1999; Streit y col., 2000; Sheng y col., 2003; Puelles y col., 2005; Khudyakov y col., 2009). Los mapas de destino publicados de la placa neural de pollo, la cresta neural y el tubo neural dorsal en estadios HH4 y HH8 (Cobos y col., 2001; Fernández-Garre y col., 2002; Rodríguez-Gallardo y col., 2005; Ezin y col., 2009) no han sido utilizados para examinar como el campo del prosencéfalo se vuelve molecularmente regionalizado en los distintos subdominios rostrocaudal y dorsoventral en correlación con los datos de mapa de destino. Tal correlación de los datos experimentales con el patrón molecular fue el objetivo principal del presente estudio. Además, nosotros examinamos otros dominios anteriores que están involucrados en el establecimiento temprano del límite neural anterior y el origen de la adenohipófisis. El surco neural anterior (ANR, anterior neural ridge) es un dominio que incluye la región más rostral y dorsal del cerebro, correspondiendo con el prospectivo telencéfalo y diencéfalo, y su límite periféricamente con las células no neurales ectodérmicas (Houart y col., 1998). Esta población de células actúa protegiendo las células del prospectivo prosencéfalo de las señales caudales (Stern y col., 2006). El perfil molecular del surco neural anterior, varía significativamente acorde con el estadio embrionario, volviéndose primero visible en estadios de gastrula, y modificándose en estadios posteriores. Este proceso es conducido por una red compleja de señales procedentes desde derivados prospectivos del techo prosencefálico, tal como septum de la línea media, tejido coroideo del telencéfalo y el diencéfalo, la epífisis y el techo del pretecho (el órgano subcomisural). El mecanismo que establece el borde neural /no neural en la periferia del surco neural anterior no esta aun totalmente entendido. El origen embrionario de la adenohipófisis ha estado en controversia. En mamíferos y aves, el lóbulo anterior de la pituitaria (adenohipófisis) se forma eventualmente bajo el hipotálamo desde la bolsa de Rathke, la cual esta formada desde una evaginación dorsal del ectodermo del estomodeo anterior a la placa oral (Rathke, 1838). Takor y Pearse (1975) propusieron que la prospectiva adenohipófisis es derivada desde el neuroectodermo del surco neural anterior, basado en el análisis descriptivo de embriones de pollo. La mayoría de los estudios experimentales en varios modelos animales sugieren un origen neural para la pituitaria anterior, aunque los experimentos con marcaje o transplantes no pueden distinguir estrictamente los derivados desde el surco neural anterior o desde las células no neurales mediales vecinas (Couly y LeDouarin, 1985; 1987; Eagleson y Harris, 1990; Eagleson y col., 1995; Kondoh y col., 2000; Treier y col., 2001). Estos autores sostienen que este dominio neural presuntivo de la adenohipófisis forma parte de, o se extiende cerca, del futuro hipotálamo, el cual ellos localizan rostralmente en la placa neural (esta idea probablemente extiende suposiciones de que el área preóptica pertenece al hipotálamo; sin embargo, la caracterización molecular moderna ha permitido reemplazar el área preóptica al dominio inicialmente concebido (His, 1893), como un componente del subpalio telencefálico (Puelles y Rubenstein, 2003; Puelles y col., 2004, 2007). Estudios de mapa de destino mas discriminativo mostraron que el esbozo de la adenohipófisis esta localizado en el dominio extraneural de la línea media en los estadios de neurula temprana, HH8 (Rubenstein y col., 1998; Cobos y col., 2001; Fernandez-Garre y col., 2002). Sin embargo, estos autores atendieron principalmente a los dominios neurales del prosencéfalo y dieron algunas atenciones colaterales del primordio de la adenohipófisis, sin centrarse detalladamente. Nosotros examinamos en más detalle esta hipótesis de un origen no neural. Tras su segregación como una vesícula fuera de la bolsa de Rathke, la adenohipófisis se desarrolla bajo la influencia de señales procedentes del prosencéfalo ventral (prospectivo hipotálamo basal) (Sheng y Westphal, 1999). El conocimiento molecular de las cascadas involucradas causalmente en la especificación de la adenohipófisis ha mostrado algunos progresos. Las señales Six3 y Hesx1 juegan un papel importante en la regulación de la proliferación celular de la pituitaria anterior, tanto como en el desarrollo del prosencéfalo anterior (Martinez-Barbera y Beddington, 2001; Lagutin y col., 2003). Ambas moléculas regulan la represión de la vía Wnt/? catenina, la cual es necesaria para el desarrollo normal de la adenohipófisis (Gaston-Massuet y col., 2008). OBJETIVOS - El primer objetivo fue determinar experimentalmente el destino neuroepitelial acompañado de la regionalización molecular anteroposterior de la placa neural anterior dentro del prosencéfalo secundario y el diencéfalo entre los estadios HH4 y HH8, considerando a su vez la especificación inicial de los principales dominios dorsoventrales. - Caracterizar dónde se localiza el límite neural anterior y su límite periférico definidos en términos celular y molecular durante el intervalo desde inducción neural temprana hasta los estadios de tubo neural temprano. Esto implica además examinar como el borde neural anterior es fijado por los mecanismos de morfogenéticos y moleculares, los cuales conjuntamente promueven la especificación diferencial final de las poblaciones celulares neural y no neural. - Determinar por mapa de destino el origen de la adenohipófisis o bolsa de Rathke con respecto a los dominios prospectivos del prosencéfalo secundario (complejo telencéfalo-hipotálamo) y seguir el primordio desde estadios de placa neural hacia estadios mas avanzados. Las características topológicas de la relación secundaria con el dominio basal del hipotálamo y la neurohipófisis fueron además de interés, en orden de entender completamente el desarrollo de la glándula pituitaria. MATERIAL Y METODOS Nuestros experimentos de mapa de destino (Tablas III-X) fueron obtenidos realizando trasplantes homoespecíficos, homotópicos e isocrónicos marcados con CFSE verde fluorescente e inyecciones localizadas con carbocianinas en embriones huéspedes sobre cultivos de New en el estadio HH3d/4 (Hamburger y Hamilton, 1951) (Gallus gallus domesticus; New, 1955; protocolo modificado por Stern y Bachvarova, 1997), acorde al protocolo descrito por Fernández-Garre y col. (2002) (Fig.19). El estadio HH4 de embriones de pollo aproximadamente corresponde con el estadio larvario del pez cebra en el estadio intermedio de gastrula (90% epibolia) (Kimmel y col., 1995). Este estadio es el equivalente a 10c (7.5 dpc) en embriones de ratón (Theiler, 1989). Microcirugía Una retícula acoplada en el ocular de la lupa fue centrada en el nódulo de Hensen exactamente como fue hecho por Fernández-Garre y col. (2002) siguiendo la posición del transplante en el epiblasto huésped como un lugar especifico seleccionado de la placa neural mapeada en HH4. Inmediatamente después del transplante, el embrión operado fue fotografiado bajo iluminación fluorescente utilizando una cámara Axiocam (Carl Zeiss Vision; München-Hallbergmoos). Los embriones fueron cultivados hasta que alcanzaron diferentes estadios del desarrollo, normalmente entre HH5 y HH12. Posteriormente, los embriones supervivientes fueron fijados toda la noche con paraformaldehído (PFA) frío al 4% (tampón fosfato pH 7.4, 0.1M, 4ºC) y fueron almacenados en PBS frío hasta su posterior procesamiento (máximo 4 horas). Las carbocianinas 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI; Invitrogen, D282) y 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO; Invitrogen, D275) fueron utilizadas para marcaje in situ, siguiendo los métodos previamente descritos (ver Stern, 1990; Selleck y Stern, 1991). La inyección con estos marcadores fluorescentes (DiI/DiO) fue realizada aspirando a través de una goma donde esta colocado el capilar que contiene la solución de marcaje (Fig. 21). Bajo excitación fluorescente, el marcaje fue visualizado en rojo para la señal de DiI y en verde para DiO (Hatada y Stern, 1994). Electroporación Las actividades de las secuencias reguladoras N1 y N2 de Sox2 fueron visualizadas mediante los vectores de expresión mRFP1 y EGFP, respectivamente, en embriones de pollo electroporados en estadio HH3+ y transferidos a cultivo de New (las condiciones de electroporación fueron previamente descritas por Voiculescu y col., 2007; 2008). Después de 4 horas, las células comienzan a expresar fluorescencia como consecuencia de la actividad de la secuencia. Algunos experimentos fueron grabados por videos a tiempo real (time-lapse). Los embriones fueron fijados entre diferentes estadios del desarrollo HH4+/9. Posteriormente fueron almacenados en PBS hasta el ulterior procesamiento. Time-Lapse Algunos embriones experimentales fueron grabados utilizando un equipo de microscopia Leica SP2 con un láser infrarrojo Tsunami XI y una cámara termo-regulada. Nosotros seguimos el procedimiento descrito por Voiculescu y col. (2007). Los embriones experimentales fueron grabados cada dos horas. Tras completar el video, los embriones se fijan en paraformaldehído frío al 4% y más adelante se procesan. Hibridación in situ Los embriones in toto fueron hibridados siguiendo el protocolo descrito por Conlon y Rossant (1992), Shimamura y col. (1994) y Stern (1998). Los genes utilizados están listados en la Tabla II. Para este estudio, normalmente utilizamos sondas antisentido de pollo marcadas con UTP-Digoxigenina; ocasionalmente realizamos dobles hibridaciones, utilizando sondas marcadas con UTP-Fluoresceína para el segundo marcador. La visualización estándar se lleva a cabo con la solución NBT/BCIP, como sustrato de la enzima alkalina fosfatasa dando un color azul oscuro en el producto de la reacción para UTP-Digoxigenina, mientras que el producto INT/BCIP (color rojo) fue usado para detectar la ribosonda marcada con UTP-Fluoresceína. Detección de la señal fluorescente mediante inmunoquímica y foto-oxidación de carbocianina Las células derivadas del transplante marcadas con CFSE fueron identificadas con el anticuerpo anti-Fluorescein Fab conjugado a la enzima peroxidasa (anti-fluorescein-POD; Boehringer; Mannheim). Tras detectar la reacción de la peroxidasa con DAB/H2O2 se detiene la reacción con Tris 0.05M, pH7.5 y tras repetidos lavados el embrión se postfija toda la noche con paraformaldehído 4% a 4ºC. A continuación los embriones se deshidratan hasta glicerol 75% en tampón fosfato con 0.4% PFA (0.1M, pH 7.4) y se fotografían y almacenan. Para detectar las células marcadas con DiI, la fluorescencia fue foto-convertida con diaminobencidina (DAB) insoluble por foto-oxidación (descrito por Stern, 1990; Selleck y Stern, 1991). Histología Para obtener secciones de los embriones, estos fueron deshidratados a través de series de etanol (30%, 50%, 70%, 90%, 100%; 10 minutos cada paso) y en butanol absoluto (10min), seguido de un lavado de parafina/butanol 1:1 (durante 10min a 60ºC). Finalmente varios lavados de parafina pura (1hora cada lavado) antes de preparar el bloque. Las secciones transversales fueron obtenidas con un grosor de 10 µm y montadas en portas. Estos fueron desparafinados en xilol y cubiertos con Eukitt. Algunos especimenes fueron fijados toda la noche con PFA 4% y lavados con PBS frío, crioprotegidos toda la noche con sacarosa 10% en PBS, y finalmente embebidos en gelatina 10% y sacarosa 10% en PBS. Los bloques fueron crioseccionados a 10-12 µm de grosor en plano sagital. Después, las secciones fueron adheridas en portas SuperFrost-Plus (Menzel-Gläser, Braunschweig, Germany). Imágenes Las microfotografías de las secciones fueron capturadas con una cámara digital AxioCam (Carl Zeiss Vision; München-Hallbergmoos) acoplada al microscopio. El procesamiento de las imágenes fue llevado a cabo por el programa Adobe PhotoShop 7.0.1 (Adobe Systems; San José, CA). La realización de los esquemas fue llevada a cabo utilizando el programa Deneba Canvas 8. RESULTADOS Y DISCUSION Cambios en el mapa de destino de la placa neural en HH4 Exceptuando el campo del ojo, la mayoría de los subdominios prosencefálicos no fueron precisamente mapeados en estadio de placa neural (Fernandez-Garre y col., 2002). Tras nuestros experimentos el mapa de destino en HH4 resulto expandido o corregido en algunos aspectos como, la localización del limite interprosencefálico y el relativo tamaño de la placa del suelo, basal y campo del ojo. En HH4, el límite interprosencefálico que separa el hipotálamo (prosencéfalo secundario) del diencéfalo resulta mapeado como una curva caudalmente convexa formando aproximadamente un ángulo de 30º con la línea media (Fig. 36). Esta localización fue determinada por los casos experimentales PL26 y PL34 (descritos en resultados) entre otros no mostrados. En HH8, el limite interprosencefálico forma un ángulo de 80º con la línea media, alcanzando el borde de la placa aproximadamente a una distancia topológica de 220-250 µm caudal desde el extremo anterior neural (Fig. 36). El prospectivo campo del telencéfalo en HH4 forma un arco hacia la parte dorsal de la placa rostral alar (por referencia del eje longitudinal prosomérico y el destino conocido de la placa del techo en la placa neural), esta posición es a menudo interpretada alternativamente como la "parte rostral" del primordio neural (por referencia del eje columnar longitudinal, hoy en día considerado obsoleto). En HH4, estimamos que el campo del telencéfalo se extiende entre 0-30º desde el nodo. Su borde ventral topologicamente, con el subyacente dominio del hipotálamo alar fue estimado como un arco aproximadamente entre 220µm (en 0º) y 400µm (en 30º) alejado del nodo (Fig. 36B). El dominio hipotalámico alar contiene el campo del ojo en una porción concéntrica la cual ocupa una mayor parte de su extensión. El campo del ojo obtenido por nosotros en HH4 es mas pequeño al descrito inicialmente en el trabajo de Fernández-Garre y col., (2002). Por otro lado es cercano a la dimensión deducida por Cobos y col. (2001) (ver casos en Fig. 36D). El prospectivo limite alar/basal fue mapeado tentativamente dentro del prosencéfalo secundario por Fernández-Garre y col., (2002). Nosotros analizamos este límite con acuerdo a la expresión del marcador alar Pax6, y extrapolamos nuestros datos dentro del mapa de destino de Cobos y col. (2001) en estadio HH8, cuando los genes Shh y Ganf identifican molecularmente la identidad alar/basal. Nosotros concluimos que el limite alar/basal esta localizado en la línea media 175µm rostral del nodo, mientras que a niveles diencefálicos (prosencéfalo caudal) se extiende aproximadamente a 190µm fuera del nodo (Fig. 36; 45). En HH4, la placa del suelo se extiende a 150µm desde el nodo en la línea media y la placa basal es 25µm de ancho. En particular, nuestros datos corroboran que los transplantes realizados en la placa basal en el prosencéfalo rostral producen derivados basales que después expresaran Shh, localizados rostralmente de los derivados basales diencefálicos obtenidos de transplantes mas laterales (Fig. 37 y Tablas IV, VI; caso PL64). Por otro lado, los resultados obtenidos en la dimensión de la placa del suelo indican que es mas amplia que la propuesta por Fernández-Garre y col., (2002). Además proponemos una subdivisión interna de la misma, la placa paramediana (dorsalmente) y mediana (ventral) del suelo. Los criterios utilizados para añadir esta subdivisión fueron dos; el primero de ellos, identificar los derivados de la placa del suelo los cuales deberían extenderse caudalmente a medida que el nodo regresiona (Darnell y col., 2000; López-Sánchez y col., 2001). El segundo criterio es la expresión de Shh y Chordin que se extienden al dominio de la placa del suelo en estos momentos del desarrollo. Posteriormente, el tejido de la placa del suelo mediana contiene ambos criterios, dado que la placa paramediana expresa ambos genes pero no se extiende caudalmente, sino que presenta una restricción clonal dentro de los dominios más rostrales de la placa del suelo. El limite longitudinal que separa la placa del suelo paramediana y mediana a niveles rostrales de la placa neural (incluyendo el prosencéfalo y el mesencéfalo de la línea media) son respectivamente 40µm y 110µm de ancho en el estadio HH4 (Figs. 36B, 45A). En términos de derivados dorsales de la placa neural rostral, nuestros resultados están en acuerdo con el reciente mapa de destino de la cresta neural y derivados del tubo neural dorsal de pollo realizado por Ezin y col. (2009). Estos autores contribuyen con datos obtenidos en el análisis de los prospectivos dominios rostrocaudales en el tubo neural, pero no añaden datos sobre los dominios prospectivos dorsoventrales en el prosencéfalo rostral (telencéfalo, campo del ojo y el hipotálamo). Regionalización temprana de la placa neural anterior Brevemente después del estadio HH4, la placa neural anterior en embriones de pollo muestra campos de expresión génica diferencial la cual seguimos para inicialmente vislumbrar la individualización progresiva de los dominios diferencialmente especificados, indicando el progreso de su regionalización primaria (Chapman y col., 2002; Wittler y Kessel, 2004; Puelles y col., 2005; resultados presentados). En orden de atribuir significados morfológicos a estos patrones de expresión génica, particularmente en el área prosencefálica prospectiva, es necesario establecer una correlación de la especificación molecular local con el mapa de destino histogenético del primordio del prosencéfalo. Al comienzo del periodo de estudio, la combinación de patrones de expresión génica mostró un solapamiento de los diferentes dominios mapeados por destino a lo largo de la placa neural anterior (Figs. 45A, B). Varios de los patrones estudiados (Six3, Ganf y Otx2) son retroregulados rostralmente, posiblemente como resultado de la mutua inhibición dinámica de Wnt/antiWnt. Sin embargo, brevemente después (HH4+/5), algunas subdivisiones longitudinales, tal como las placas del techo y del suelo, comienzan a ser establecidas, determinado por la relación entre la expresión de Pax6, o de Shh y Chordin, respectivamente, con el destino de los transplantes localizados dentro de sus dominios de expresión. En contraste los dominios moleculares AP en el prosencéfalo no están del todo fijados, debido a la retracción rostral de los dominios de expresión de Six3 y Ganf (mas la expansión caudal de Pax6 en el borde neural), pero el par Otx2/Gbx2 sin embargo si que parece tener estabilizado el limite caudal del mesencéfalo prospectivo (Figs. 45A, B), indicando por lo tanto, un comienzo temprano de desarrollo AP. Brevemente después, HH5+/6, los efectos de señalización secundaria originados desde los tejidos extraneurales como el mesendodermo anterior, y el mesodermo axial (placa precordal y notocorda) permiten una aproximación de las identidades moleculares, generando entre otros aspectos la forma del limite alar/basal (Figs. 45C, D) y el limite transversal mes-diencefalo (Fig. 38C; esto se dedujo en el trabajo de Ferran y col. (2007) para estadios en HH9-10). La consecuencia final en estadios HH7/8, siguiendo cambios drásticos en los dominios de expresión de Ganf y Six3, es una diferenciación molecular primaria del prospectivo prosencéfalo en términos de dominios longitudinal y dorsoventral (placa del techo, alar, basal y suelo, o telencéfalo, hipotálamo alar con el campo del ojo, hipotálamo basal y hipotálamo del suelo). En los dominios transversales anteroposteriores (rostral y caudal hipotálamo y diencéfalo con prosomeros 1-3). El establecimiento del campo telencefálico inicial probablemente sucede en estadio HH8/9, secundariamente a la sobreregulación de Fgf8 y Bf1 en el endodermo anterior y en el ANR (Bell y col., 2001; Chapman y col., 2002; resultados presentados). Acorde con las definiciones axiales propuestas por Shimamura y col. (1995) y Puelles (1995, 2001), la separación del campo del telencéfalo en las regiones del subpalio y del palio es topologicamente un efecto de desarrollo anteroposterior dentro de la parte dorsal de la placa neural (Cobos y col., 2001; resultados presentados). Esto contrasta con el habito extendido de describir las subdivisiones telencefálicas como dorsoventrales desde un punto de vista no topológico, situando al subpalio bajo el palio (Wilson y Rubenstein, 2000). Esta partición palio-subpalial puede ser asumida desde estadios HH8/9, basados en parte por los datos de mapa de destino junto con los patrones de expresión en el ANR, tal como Ganf, Pax6 y Fgf8. El borde neural anterior, establecimiento y señalización El borde neural anterior no esta bien definido en el estadio HH4, aun así caracterizado por significantes movimientos de intercalación celular entre los dominios prospectivos neural y no neural como fue determinado por mapa de destino (Fernandez-Garre y col., 2002; Ezin y col., 2009; datos presentados con marcaje de DiI/DiO). Después, aproximadamente en estadio de pliegue cefálico, HH5/6, las poblaciones neural y no neural se segregan en un borde definitivo; las células individuales o grupos celulares pueden intercalarse dentro de cada dominio, pero no cruzan el borde, indicando la adquisición final de los respectivos destinos. Nosotros describimos dos patrones diferentes de intercalación durante el establecimiento del borde: 1. En la línea media, el ectodermo anterior esta destinado a producir la adenohipófisis extraneuralmente, y la piel adyacente y el ectodermo del estomodeo, tanto como un conjunto de derivados neurales (los dominios prospectivos preóptico, quiasma óptico y el hipotálamo). Los clones de la línea media son caracterizados por la exclusiva intercalación dorsoventral y ellos nunca se expanden dentro de los dominios topologicamente caudales (Fig. 47). 2. Por otro lado, los precursores del dominio bilateral más caudal contribuyen a la placoda extraneural olfatoria, la piel contigua y los dominios neurales del telencéfalo, el ojo y el diencéfalo. Los clones derivados se expanden entre HH4 y HH8 por intercalación rostrocaudal (ver desplazamiento del limite interprosencefalico desde su posición angular temprana 30º a una posición de 80º durante este periodo, como se menciono arriba), con menor crecimiento dorsoventral topologicamente (Fig. 49). El análisis molecular refleja los cambios dinámicos en la expresión génica del límite neural anterior en los estadios tempranos, comenzando en HH4. Los marcadores neurales (como Sox2, Otx2, Six3, Ganf) inicialmente no alcanzaron el destino mapeado de los dominios dorsales neural prospectivo de la placa neural anterior (los dominios dorsales prospectivos del telencéfalo y diencéfalo alar y del techo). Además, estos prospectivos dominios neurales carecen momentáneamente de genes neurales y se expresan por el contrario genes no neurales en HH4 (por ejemplo, Bmp4, Dlx5). Posteriormente, en HH5/6, y acompañado de la segregación del borde y de los movimientos de intercalación celular descritos, el límite del borde neural anterior comienza a ser molecularmente establecido por retroregulacion local de los genes no neurales y activación de marcadores neurales. Las poblaciones neural y no neural se vuelven claramente separadas molecularmente y en el estadio HH8/9 es posible identificar con apropiados marcadores el surco neural anterior, el prospectivo telencéfalo, el dominio extraneural preplacodal y, caudalmente, la cresta neural prosencefalica. En mamíferos, el endodermo anterior visceral (AVE, anterior visceral endodermo) es responsable inicialmente del establecimiento de la identidad más anterior, y es requerido para la formación de la cabeza (Thomas y Beddington, 1996; Martinez-Barbera y Beddington, 2001). En embriones de pollo, el hipoblasto es el homologo del AVE en mamíferos. El hipoblasto transitoriamente expresa un conjunto de marcadores muy tempranos (algunos de los cuales están después expresados en el sistema nervioso y particularmente en el prosencéfalo) (Albazerchi y Stern, 2007). El hipoblasto o el endodermo rostral, expresa proteínas secretadas las cuales inhiben la formación de la línea primitiva, tal como los antagonistas de Nodal, y Gsc y Cerberus (Bertocchini y Stern, 2002). Nosotros exploramos el papel del endodermo rostral en la formación del borde neural anterior. Un interesante resultado es que Six3, un marcador neural anterior, es ausente en el dominio del telencéfalo cuando el endodermo rostral es selectivamente removido en el estadio temprano HH4 (Fig. 52). La señal Fgf aparece en el endodermo rostral antes de que se active en el surco neural anterior. La inhibición experimental de esta señal Fgf temprana desde el endodermo rostral causa una ausencia o reducción de la expresión de Six3 en el dominio telencefálico rostral, el prospectivo subpalio (Fig. 52). Por lo tanto, la señal endodérmica Fgf puede estar implicada por señalización vertical en el establecimiento del borde neural anterior, particularmente en la especificación del dominio prospectivo telencefálico. Seguidamente, la señalización de Fgf originada desde el borde neural anterior ya especificado, promueve la regionalización dorsoventral del prosencéfalo (telencéfalo contra hipotálamo alar) y la regionalización anteroposterior (subpalio contra palio dentro del campo telencefálico). La prospectiva adenohipófisis McCabe y Bronner-Fraser (2009) recientemente revisaron la localización del primordio de todas las placodas desde el estadio HH5 hasta HH14, e incluyen que el tejido extraneural destinado a volverse la adenohipófisis es la placoda más anterior. Sin embargo, la prospectiva adenohipófisis no esta bien caracterizada experimentalmente en el estadio HH4. En orden de localizar la posición de la placoda más rostral con respecto a la placa neural anterior prospectiva, realizamos un mapa de destino detallado acompañado de datos moleculares obtenidos entre HH4 y HH13. Corroboramos que el origen de la adenohipófisis es extraneural (Rubenstein y col., 1998; Cobos y col., 2001; Fernandez-Garre y col., 2002). En el estadio temprano de placa neural, HH4, esta localizada aproximadamente dentro de un área distante del nodo de 260-290 µm en el ectodermo no neural de la línea media rostral (Fig. 61). El borde medial neural se extiende a 250 µm desde el nodo (Fernandez-Garre y col., 2002; corroborado por los resultados presentes). El dominio del ectodermo no neural, extendido lateral a la placoda adenohipofisaria, corresponde con el prospectivo ectodermo lateral de la cabeza, y se localiza separado tanto del primordio de la adenohipófisis como de la placoda olfatoria. El dominio extraneural preplacodal inicialmente expresa de forma similar el mismo patrón de expresión para todas las placodas rostrales, incluyéndose la adenohipófisis. Sin embargo, los precursores tempranos de la bolsa de Rathke identificados en HH4 son poblaciones individuales bien separadas de la placoda olfatoria (Fig. 61). Posteriormente, en HH8, la regionalización progresiva permite la individualización molecular de los diferentes dominios placodales, y la prospectiva adenohipófisis comienza a ser especificada molecularmente (por ejemplo, Six3, Ganf, Pitx2, Cytoqueratin8) como un estrechamiento a lo largo de la línea media. En estadio HH11/13, las células derivadas del dominio primario de la adenohipófisis construyen la incipiente bolsa de Rathke, localizada próxima a la placa basal hipotalámica. Ellas corresponden topologicamente con los derivados mas distantes desde el borde neural anterior en el lugar inicial en HH4, desde que el ectodermo de la cabeza separa la bolsa desde el neuroporo anterior además deriva dese el esbozo medio temprano, cerca del surco neural anterior (Fig. 72). Finalmente, después de que el tubo neural se curva hacia la flexura cefálica, la adenohipófisis esta en contacto por el tallo neurohipofisario (formado desde el hipotálamo entre HH25/26) y esto permite la formación de la definitiva glándula pituitaria (Gleiberman y col., 1999).