Nuevas peroxidasas de origen vegetalaislamiento, caracterización y aplicaciones

Zusammenfassung

En el trabajo realizado se estudian diferentes aspectos de la peroxidasa de la planta de lenteja (Lens culinaris), LPP, y de la peroxidasa de escoba blanca (Cytisus multiflorus), CMP, dos de las peroxidasas más activas y estables encontradas en la búsqueda sistemática de actividad peroxidasa entre residuos agrícolas abundantes en la comunidad autónoma de Castilla y León. En el Capítulo I se ha demostrado la aplicabilidad analítica de los extractos vegetales con actividad peroxidasa, sin necesidad de aislar ni purificar la enzima. Este hecho repercute de forma drástica en la simplicidad y en el coste de las aplicaciones analíticas. En este sentido se ha utilizado el extracto crudo de la planta de lenteja para la determinación del nivel de sarcosina en orina, parámetro éste que en los últimos cinco años ha generado un cierto interés, no exento de polémica, por su aparente relación con el diagnóstico precoz del cáncer de próstata. La reacción de la peroxidasa se ha llevado a cabo utilizando como sustrato una mezcla de 4-aminoantipirina (4-AAP) y ácido 2,4,6-tribromo-3-hidroxibenzoico (TBHBA) con medida espectrofotométrica de la quinonaimina producida. Esta reacción se ha acoplado a la oxidación de sarcosina con oxígeno en presencia de sarcosina oxidasa. Como resultado de la optimización de la reacción global resultante del acoplamiento, se ha propuesto un procedimiento para la determinación de sarcosina, en concentraciones adecuadas para el diagnóstico de individuos enfermos (valores típicos entre 2x10-6 y 3x10-5 M en orina de 24 h). El procedimiento propuesto se ha aplicado satisfactoriamente al análisis de muestras de orina dopadas. Dado que la mayoría de las aplicaciones conocidas de las peroxidasas se llevan a cabo con enzimas puras, en el Capítulo II se estudia y optimiza el proceso de extracción y purificación de peroxidasas vegetales, concretamente de la peroxidasa de la planta de escoba blanca. El procedimiento propuesto consta de una primera etapa de aislamiento y concentración. A continuación se separan los compuestos fenólicos (inhibidores de la actividad peroxidasa) presentes en el extracto y finalmente se lleva a cabo un procedimiento de purificación consistente en consecutivas etapas cromatográficas de interacción hidrofóbica, intercambio iónico y exclusión molecular, obteniéndose un rendimiento final del 38%. Finalmente, puesto que la estabilidad y características cinéticas de las peroxidasas pueden ser determinantes de sus potenciales aplicaciones biotecnológicas, en el Capítulo III se lleva a cabo la caracterización de la peroxidasa de escoba blanca (CMP) obtenida y purificada según el procedimiento del capítulo precedente. Se ha encontrado que dicha peroxidasa es monomérica en disolución, con una masa molecular de 55 ¿ 3 kDa, que coincide con la encontrada para otras peroxidasas vegetales. Su estructura secundaria se encuentra dominada por a-hélices. Su desnaturalización térmica, estudiada por dicroísmo circular y fluorescencia intrínseca, se ajusta al modelo de dos estados y resulta ser un proceso irreversible controlado cinéticamente con una temperatura de transición de 55±2 ºC. Al igual que otras muchas peroxidasas vegetales descritas, el ciclo catalítico de CMP sigue un mecanismo de tipo ping-pong Bi Bi y presenta inactivación por sustrato suicida. Los valores de las constantes cinéticas del proceso de inactivación, así como los números de recambio calculados sugieren que CMP presenta una mayor resistencia a la inactivación por peróxido de hidrógeno que otras peroxidasas descritas, siendo por ello una potencial alternativa comercial a la peroxidasa de rábano picante (HRP) en diferentes aplicaciones biotecnológicas.