Acción regeneradora de los miofibrillas mediante la aplicación de monocitos medulares (cmn) en tejido muscular alterados por al acción del bisfenol A

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis Son numerosos los contaminantes ambientales que pueden actuar como disruptores endocrinos (EDCs) modificando el equilibrio del sistema endocrino y secundariamente el esquelético, se han multiplicado el número de estudios científicos implicados en la investigación de los mecanismos de acción tóxica de estos compuestos y las repercusiones que tienen sobre el medio ambiente y la salud (Mandich et al., 2007; Molina et al., 2013; Canesi & Fabri, 2015; Giménez et al., 2016; Lora et al., 2016; Barasona et al., 2017). La mayoría de estas sustancias con actividad endocrina generan sus efectos como consecuencia de su acción por la similitud estructural que poseen con las hormonas esteroideas siendo capaces de provocar, en las células diana, una respuesta parecida a las de las hormonas endógenas o bien inhibir dicha respuesta ejerciendo un efecto antagónico, por ello, los compuestos más estudiados son aquellos capaces de mimetizar los efectos de los andrógenos y los estrógenos sobre el organismo. El Bisfenol A (BPA), es un conocido EDC, presente en una gran variedad de productos de consumo, de los cuales un elevado número de ellos entran en contacto directo con el alimento, tales como envases de bebidas, o en el recubrimiento interno protector de las latas de conservas entre otros, siendo además utilizado en múltiples bienes de consumo no alimenticios, tales como sellantes dentales, equipos y material médico, lo que podría llegar a constituir un problema de salud pública (Vanderberg et al., 2007; Mileva et al., 2014). Debido a la actuación beneficiosa producida en los procesos degenerativos en general y musculares en particular, de las sustancias paracrinas de los monocitos de medula ósea, se están utilizando estos compuestos en el tratamiento de patologías musculares, el uso de los monocitos se realiza en altas dosis por vías sanguíneas o tratamientos directos de la zona que se pretende estudiar, y también se recomienda ambos tratamientos simultáneamente. Los efectos del BPA en las fibras musculares podrían ser reversibles, por lo que el uso de tratamiento con monocitos para la recuperación de las fibras podría ser aplicable. El presente trabajo de investigación consta de dos fases diferentes, en primer lugar y con una dosis diaria de BPA, estudiaremos las posibles alteraciones que los EDC podrían producir en las fibras musculares, y de forma paralela, analizaremos las modificaciones que acontecen en los fibrocitos y fibras de colágeno. En segundo lugar y una vez comprobado la acción del BPA, evaluaremos si los factores de tratamiento paracrinos, que actúan por acción directa sobre las fibras musculares y conectivas, pueden provocar una recuperación de las mismas. 2.contenido de la investigación Con esta investigación nos propusimos como objetivo evaluar los efectos a nivel muscular del bisfenol A, su posible reversión tras la retirada de la exposición, y su recuperación tras la aplicación de plasma enriquecido con monocitos medulares. Para ello, Se utilizaron 16 cerdos “Minipig” de 2 meses de edad. El procedimiento experimental se realizó en el Servicio de Animales de Experimentación de la Universidad de Córdoba (SAEX), todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Córdoba y se realizaron cumpliendo en todo momento las directrices del Real Decreto 53/2013 de 1 de febrero sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, así como la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Los Minipig se distribuyeron al azar a uno de los cuatro grupos experimentales: Grupo control (GC), (n=4), el grupo tratado con BPA (n=4) oralmente con 1 mg/kg/day (Sigma Aldrich®, St. Luis, EE.UU.) durante cuatro meses, un tercer grupo BPA-retirada (n=4) a los que tras dos meses de tratamiento se le retiró el BPA durante otros dos meses hasta la biopsia. Y un cuarto grupo tratados con monocitos medulares (PRP) (n=4), a los animales de este último grupo se les trató con BPA durante 2 meses, después se le retiró y comenzó el tratamiento con CMN. Se les inyectó en los músculos Longissimus lumbaris y longíssimus dorsis mediante una aguja de biopsia percutánea, una dosis semanal de CMN, durante tres semanas. Al acabar los distintos periodos de exposición, tratamiento y/o retirada según el grupo de estudio, se recogieron muestras mediante biopsia de ambos mésculos, para su posterior estudio. Las CMNs fueron extraídas de MO procedente del fémur y la tibia de minipig. La cavidad medular de ambos huesos fue lavada repetidas veces con 10mL de suero salino realizando varios lavados. La suspensión de lavado obtenida fue recogida en tubos estériles, filtrada y posteriormente lavada mediante centrifugación durante 5 minutos a 4C. Finalizado el lavado, el sobrenadante fue descartado y el pellet con el concentrado celular de la MO de ambos huesos se resuspendió en 1mL de suero salino con antibiótico. De la suspensión celular medular se eliminó la fracción eritrocítica y los granulocitos para el enriquecimiento de la fracción de CMNs mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Lymphoprep™ (Oslo, Norway). Se centrifugó durante 20 minutos a 1500g y 20C. Finalizada la centrifugación, el halo de CMNs concentrado fue recogido. Esta suspensión de CMNs fue lavada añadiendo 5mL de solución salina tamponada (PBS, phosphate-buffer saline) para eliminar completamente los restos de Ficoll. El pellet resultante fue resuspendido en un medio proteico (suero fetal bovino, FBS, Fetal Bovine Serum) a una concentración de 5106 CMNs/mL, se determinó la viabilidad celular mediante el método de tinción por exclusión con Azul Tripán (Lonza, Verviers, Belgium) y se realizó el contaje celular en cámara de Neubauer. Esta suspensión celular fue utilizada para la realización de los estudios in vitro o la administración como tratamiento en el estudio in vivo. Se utilizó la histología como herramienta fundamental en la evaluación de los músculos tras la exposición al bisphenol A (Inmunohistoquímica ; estudio estructural y ultraestructural; morfometría) In the control group a la microscopía óptica se evidenció una íntima relación entre las fibras musculares y el endomisio, perimisio y epimisio, todas estas envueltas son relativamente delgadas estructurándose como un músculo de valor cárnico. La fibra muscular es una célula multinucleada, disponiéndose dichos núcleos en posición periférica, y su material contráctil se distribuyó longitudinalmente en las denominadas miofibrillas, con las estrías transversales muy evidentes, sobre todo las bandas A e I. Con la técnica del tricrómico se detectó la relación de las fibras musculares con la fibra de colágeno del endomisio. Sin embargo, se observaron determinadas zonas musculares donde dicha actividad apareció acentuada o disminuida. La ultraestructura que presentaron fue clásica, los núcleos se dispusieron junto a la membrana plasmática que a su vez se relacionó con un microambiente muy denso, junto con la existencia de invaginaciones que configuraron los túbulos “T”. En el grupo tratado con BPA hemos observado en primer lugar, un pleomorfismo fibrilar muy marcado, con una disminución evidente del tejido graso y tejido conectivo endomisial. Dentro del pleomorfismo marcado destacó una evidente hipertrofia fibrilar, existiendo también algunas fibras de tamaño más pequeño. La hipertrofia fibrilar se acompañó de modificaciones de sus componentes. En primer lugar, existieron alteraciones del núcleo, si bien las fibras musculares son multinucleadas y de disposición periférica, gran cantidad de sus componentes se “centralizaron”, es decir, perdieron su localización y se dispusieron hacia el centro del sarcoplasma. Sin duda alguna la alteración principal que produjo el BPA en las fibras musculares fue una hipertrofia celular, que tanto en cortes transversales como longitudinales mostraron un aumento muy marcado del sarcoplasma y las miofibrillas. En el grupo de dos meses de exposición y dos de retirada del BPA, al microscopio óptico las fibras mostraron un pleomorfismo muy marcado, una hipertrofia manifiesta, con imágenes de centralización de los núcleos, pérdida de estrías y homogenización, y sobre todo degeneraciones en “huella dactilar” y canalizaciones del sarcoplasma. Sin duda, lo que más destacó específicamente de este grupo de experimentación, fue la presencia de un edema generalizado o anasarca; este edema se manifestó por la separación entre fibras, el tejido intersticial del endomisio perdió su textura normal apareciendo claro y homogenizado. En los estudios al microscopio electrónico, las fibras musculares mostraron modificaciones caracterizadas fundamentalmente por un aumento y centralización de los núcleos y sobre todo en un aumento desmesurado de las miofibrillas, que terminaron con la desorganización interna de estos miofilamentos estudiados en el grupo tratado con BPA. Específicamente se detectó un edema generalizado, apreciándose en el interior de las fibras dilataciones de los túbulos “T” y del retículo endoplásmico, y en el intersticio conectivo se evidenciaron amplias zonas muy claras con pérdida de estructura de los componentes conectivos. En el grupo tratado con monocitos el músculo mostró una proporción normal entre el tejido muscular y el tejido conectivo. La fibra muscular se manifestó como una fibra multinucleada, de núcleos periféricos, organizándose las fibrillas con las estrías normales. Con la técnica del tricromico pudimos confirmar una relación evidente entre todos sus componentes. La ultraestructura que presentaron las fibras fue relativamente clásica. Los núcleos se dispusieron junto a la membrana plasmática que a su vez se relacionó con un microambiente muy denso, con la existencia de invaginaciones que configuraron los túbulos “T”. El elemento de mayor importancia fueron las miofibrillas, lo primero que debemos indicar es que estas fibrillas contráctiles se dispusieron paralelas unas a otras y distribuidas longitudinalmente por todo el volumen celular, y en ningún momento cambiaron de sentido. En este grupo tratado con monocitos, al microscopio óptico destacaron grupos de células pequeñas multinucleadas, que se identificaron con células satélites o mioblastos. Su ultraestrucutura mostró unas células de bordes irregulares, incluso siendo difícil identificar sus bordes, destacándose la presencia de numerosos núcleos y lo que fue más importante material contráctil de miosina y actina, formando miofibrillas. 3.conclusión En conclusion, mediante la exposición al BPA, conseguimos establecer un modelo de necrosis y degeneración de las fibras musculares, que sirviera de partida de tratamientos para su recuperación por activación de los mioblastos y de las propias fibras musculares. Pudimos observar cómo tras la retirada del BPA existió una recuperación parcial de las modificaciones histológicas aparecidas a nivel muscular. Por otro lado, el tratamiento con monocitos puso de manifiesto la capacidad regeneradora de estos compuestos sobre un músculo dañado tras la exposición a un xenoestrógeno. 4. bibliografía Barasona M, Molina A, Blanco A, Ayala N, Moyano R. 2017. Assessment of the effects of bisphenol-A as a disruptor on ionic regulation in zebrafish through a study of their chloride and prolactin cells. Acta Adriatica 58(1):in press Canesi L & Fabbri E. Environmental effects of BPA: Focus on aquatic species. 2015. Environmental effects of BPA: Focus on aquatic species. Dose-response: An international journal july-september 1-14 Giménez, M., A. Molina, A. Blanco, M. Ayala, R. Moyano (2016): Structural and ultrastructural evaluation of fibre muscles after exposure to Bisphenol-A, and a study of their possible recovery after treatment with platelet-rich plasma. 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