Molecular and functional characterization of one peroxidase responsible for the lignin biosynthesis in vascular plants = Caracterización molecular y funcional de una peroxidasa responsable de la síntesis de ligninas en plantas vasculares

Zusammenfassung

Resumen Zinnia elegans constituye uno de los sistemas modelos más útiles para estudiar la diferenciación en el xilema que incluye la síntesis de la pared celular secundaria, la lignificación de la pared celular, y la muerte celular programada. Además, el cultivo de células del mesófilo de Z. elegans in vitro también se ha utilizado como sistema modelo ya que la diferenciación de las células del mesófilo en traqueidas permite estudiar de manera sencilla la bioquímica y la fisiología de la xilogénesis alejados de la complejidad que imponen los tejidos vegetales. Por otra parte, Z. elegans ha resultado ser una excelente planta modelo para estudiar la implicación de las peroxidasas en la lignificación de la pared celular. Esto es debido a la simplicidad y dualidad del patrón de lignificación mostrado en los tallos e hipocotilos de esta planta y a la naturaleza básica de esta isoenzima de peroxidasa. Sin embargo, esta proteína no solo se expresa en hipocotilos y en tallos sino también en células que se encuentran en diferenciación en traqueidas. Por lo tanto, esta peroxidasa no solo cumple todos los requerimientos catalíticos impuestos para ser la candidata idónea implicada en la lignificación cumpliendo con todas las restricciones impuestas por la etapa de acoplamiento oxidativo de los alcoholes hidroxicinamilicos y polimerización, sino también debido a que su expresión es inherente en la lignificación. De hecho, su naturaleza básica no es excepcional ya que las peroxidasas básicas se expresan diferencialmente durante la lignificación en otros sistemas modelo, mostrando propiedades bioquímicas inusuales y exclusivas tales como la oxidación de las unidades siringilo. Esta Tesis se ha centrado en la realización de las actividades que conducen a un mejor entendimiento de la lignificación en Zinnia, comenzando con el estudio del patrón de lignificación, cómo se sucede este proceso, y la implicación de la peroxidasa, demostrando sus propiedades catalíticas inusuales y cómo esta enzima es regulada por el óxido nítrico (NO) y el H2O2. En relación a la producción de NO y H2O2 en los haces vasculares, utilizando la microscopía confocal láser de barrido, se observó un gradiente espacial de producción de NO inversamente relacionado con el grado de diferenciación del xilema ya que las células del xilema jóvenes, en diferenciación manifestaron una mayor capacidad para producir NO que las células del xilema completamente maduras y diferenciadas. Estos resultados demuestran la fuerte relación entre la producción de NO y la muerte celular programada que se produce durante la diferenciación del xilema y que precede a la lignificación de la pared celular. Además, la producción de NO en los cultivos celulares de mesófilo de Z. elegans que se diferencian a traqueidas, las células del mesófilo mantienen la misma propiedad mostrada por las células del xilema en diferenciación ya que la señal fluorescente se detectó, principalmente, en las células predeterminadas y en las que se encontraban en diferenciación. Por el contrario, las células aisladas del mesófilo que no habían adquirido la capacidad para diferenciarse a traqueidas, manifestaban unos niveles muy débiles de la señal fluorescente que contrastaba con la producción elevada mostrada por las células predeterminadas para diferenciarse a traqueidas. Por otra parte, mediante la utilización conjunta de técnicas de microscopía óptica y electrónica, se realizó un estudio detallado de los sitios de producción de H2O2 en el xilema en lignificación, comprobándose que en las células del xilema en diferenciación y en las células del parénquima adyacentes se localizaba la producción de H2O2 sugiriendo que estas células podrían ser las responsables de la producción de H2O2 que, posteriormente, difunde de célula a célula, a través del espacio intercelular hacia las células del xilema en diferenciación para que tenga lugar la biosíntesis de ligninas en la pared celular secundaria. Una evidencia adicional que apoyó la hipótesis planteada se obtuvo mediante la localización del H2O2 en los cultivos celulares de mesófilo de Z. elegans en diferenciación a elementos traqueales. Utilizando este sistema modelo junto con la microscopía confocal láser y el diacetato de diclorofluoresceína como sonda fluorescente, la producción de H2O2 se localizó mayoritariamente en las células del mesófilo predeterminadas para diferenciarse, detectándose un bajo nivel de H2O2 en las traqueidas completamente diferenciadas. Summary Zinnia elegans constitutes one of the most useful model systems for studying xylem differentiation, which simultaneously involves secondary cell wall synthesis, cell wall lignification, and programmed cell death. Likewise, the in vitro culture system of Z. elegans has been the best characterized since the differentiation of mesophyll cells into tracheary elements allows study the biochemistry and physiology of xylogenesis free from the complexity that heterogeneous plant tissues impose. Moreover, Z. elegans has resulted in an excellent plant model to study the involvement of peroxidases in cell wall lignification. This has been due to the simplicity and duality of the lignification pattern shown by the stems and hypocotyls, and to the basic nature of the peroxidase isoenzyme. This protein is expressed not only in hypocotyls and stems but also in mesophyll cells transdifferentiating into tracheary elements. Therefore, not only does this peroxidase fulfil all the catalytic requirements to be involved in lignification overcoming all restrictions imposed by the polymerization step, but also its expression is inherent in lignification. In fact, its basic nature is not exceptional since basic peroxidases are differentially expressed during lignification in other model systems, showing unusual and unique biochemical properties such as oxidation of syringyl moieties. This Thesis has focused on the experiments which led to a better understanding of the lignification process in Zinnia, starting with the basic knowledge about its lignin pattern, how lignification takes place, and the involvement of the basic peroxidase in the lignification process, demonstrating its unusual catalytic properties, and how this enzyme is regulated by nitric oxide and H2O2. In relation to the production of NO in the vascular bundles using confocal laser scanning microscopy, a spatial NO gradient inversely related to the degree of xylem differentiation was observed since differentiating xylem cells clearly manifest a higher capacity for NO production than differentiated xylem cells. In addition, the NO production in cultured mesophyll cells which are trans-differentiating in tracheary elements maintain the same property shown by differentiating xylem from the Z. elegans vascular bundles since the fluorescent probe was mainly observed in pro-differentiating thin-walled and differentiating (secondary cell wall forming) tracheary elements. By the contrary, mesophyll cells which have not acquired competence for trans-differentiation showed only background levels of triazolofluorescein green fluorescence. These results confirm that NO formation by tracheary elements is directly related to the early processes of xylem differentiation, which takes place immediately before the late processes of secondary cell wall formation and cell autolysis. On the other hand, a study of both localization and production of H2O2 in the lignifying xylem by the joint use of optical and electronic microscopy and 2,7-dichlorofluorescein diacetate and CeCl3 assays was carried out. Thus, H2O2 production was observed in thin-walled cells surround thick-walled xylem vessels and in the xylem parenchyma cells intercalated between xylem vessels suggesting that these cells could be responsible of H2O2 production and a degree of cell to cell cooperation is produced during lignin biosynthesis. Further evidence that supports this hypothesis was obtained by studying the production and localization of H2O2 during the differentiation of Z. elegans mesophyll cells into tracheary elements. Using this model system and confocal laser scanning microscopy and 2,7-dichlorofluorescein diacetate as fluorescent probe, H2O2 was mainly produced by both differentiating tracheary and parenchyma-like elements being the non-lignifying parenchyma-like cells the main H2O2 source and detecting a low level of H2O2 in the totally differentiated tracheary elements.