Factores que influyen en la eficiencia de la técnica de producción in vitro de embriones en pequeños rumiantes

Resumen

La presente Tesis trata algunos de los retos que actualmente atañen a la producción in vitro (PIV) de embriones de pequeños rumiantes. En la actualidad, la PIV representa una alternativa frente a las técnicas convencionales de obtención de embriones in vivo. El principal cometido de la PIV es el de imitar las condiciones fisiológicas durante el desarrollo embrionario temprano con la finalidad de generar embriones con una calidad suficiente que permita su transferencia a una hembra receptora o su crioconservación. Sin embargo, los resultados que se obtienen en cuanto a la eficiencia del proceso son bajos e inconsistentes y la calidad de los blastocistos obtenidos in vitro es inferior a los producidos in vivo incluso en especies donde esta técnica está más desarrollada, limitando un uso más amplio de esta tecnología. Asimismo, a la dificultad existente se le suma el hecho de que para especies silvestres los procedimientos para llevar a cabo estas técnicas son extrapolados de especies domésticas con sistemas de producción de embriones diferentes, generando resultados inferiores. Con el objetivo de mejorar la técnica de PIV en pequeños rumiantes, para la realización de esta Tesis se han llevado a cabo cuatro experimentos diferentes para determinar: (1) cómo la calidad de los ovocitos de oveja y cierva se ve afectada por factores ambientales como la temperatura; (2) cómo la adición de antioxidantes, en este caso la melatonina, al medio de transporte de ovarios condiciona la calidad de los ovocitos y el desarrollo y calidad de los embriones posteriormente producidos in vitro en ovino y cérvido; (3) cómo se ve afectado el desarrollo y la calidad de embriones de ovino y ciervo después de haber sido madurados y fecundados in vitro bajo distintas tensiones de oxígeno (O2) y (4) cómo la adición de suero de oveja en celo (ESS) al medio de capacitación y fecundación in vitro en ovino repercute sobre el desarrollo y calidad de los embriones obtenidos. En el primer experimento se evaluó la calidad de ovocitos denudados de células del cumulus oorophorus (cumulus) de oveja y cierva provenientes de hembras que habían sido sacrificadas durante meses cálidos del año (agosto-octubre) y fríos (febrero-marzo). La calidad se determinó mediante el análisis de expresión de genes de un total de 132 ovocitos de oveja y 172 de cierva. Ambas especies mostraron una sobreexpresión significativa (P < 0,05) en las muestras recogidas durante la temporada cálida para MnSOD, GPX1, SHC1, TP53, ITM2B, BCL2, NRF1, POLG2, AKR1B1, IGF2R, y FGF8 en ovino y MnSOD, ITM2B, NRF1, POLG2, AKR1B1 y GDF9 en cérvido, cuyas funciones estaban relacionadas con el estrés oxidativo, la respuesta antioxidante, la apoptosis, la replicación y transcripción del mtDNA, factores de crecimiento y maduración ovocitaria. Esto demuestra que la temperatura ambiental elevada afecta directamente a la calidad del ovocito a través del estrés por calor en ambas especies de pequeños rumiantes. En el segundo experimento se evaluó el efecto de la suplementación del medio de transporte de ovarios de cierva y oveja con un antioxidante, la melatonina (10-3 M). Este tratamiento, comparado con el control con suero fisiológico, no incrementó la producción de embriones en ninguna de las dos especies, aunque sí alteró la calidad tanto de ovocitos como blastocistos resultantes, mostrando una influencia positiva en el ciervo a través de la disminución de los patrones de expresión de genes relativos a la apoptosis y estrés oxidativo (SHC1, TP53 y BAX). En el tercer experimento se determinó el efecto de diferentes tensiones de O2 (21 % y 5 %) durante la maduración (MIV) y fecundación in vitro (FIV) de ovocitos de oveja y cierva, evaluando la producción de embriones y la calidad de los blastocistos resultantes. Para ello, se emplearon 873 COCs de ovino y 947 de cérvido, que se maduraron y fecundaron en una atmósfera que contenía un 5 % o 21 % de O2, que fueron madurados con 5 % y fecundados con 21 % de O2 o madurados con 21 % y fecundados con 5 % de O2. El análisis estadístico de los resultados demostró que, aunque la tasa de división a las 48 horas postinseminación en ovino era menor (P < 0,05) para el tratamiento de maduración con un 5 % de O2 y fecundación con 21 %, no se observaron diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05) en el número de blastocistos obtenidos tras 9 días de cultivo en ninguno de los cuatro tratamientos considerados para ambas especies. Por otro lado, y en ovino, el tratamiento en el cual los ovocitos se maduraron con un 21 % de O2 y fecundaron con 5 % disminuyó la calidad de los embriones tempranos, produciendo un incremento en la expresión de genes relacionados con la apoptosis, estrés oxidativo y la respuesta antioxidante (SHC1, NRF1, TP53, BAX y GPX1). Por su parte, en ciervo, el tratamiento de maduración y fecundación con un 5 % de O2 generó blastocistos de mayor calidad debido al incremento de genes relacionados con el metabolismo (G6PD), enzimas antioxidantes (SOD2) y metilación (SOX2). Por tanto, los resultados obtenidos indican que la calidad embrionaria en ovino y ciervo está condicionada por la tensión de O2 presente durante la maduración y fecundación in vitro. En el cuarto y último experimento se evaluó el uso del ESS y su sustitución con sustancias semidefinidas y definidas como la BSA y el PVA, respectivamente, durante la capacitación y coincubación de ovocitos y espermatozoides ovinos. Se realizó el cultivo de un total de 693 COCs, que fueron designados al azar a cada uno de los cuatro tratamientos considerados: capacitados y fecundados con un 10 % de ESS (n=178), capacitados al 10 % de ESS y fecundados con 2 % de ESS (n=173), capacitados con 10 % de ESS y fecundados con PVA (n=167) y capacitados con BSA y fecundados con PVA (n=175). El análisis estadístico de los resultados indicó un mayor porcentaje (P < 0,05) de división a las 48 horas postinseminación para el tratamiento cuya capacitación y fecundación había sido realizada con 10 % de ESS y de blastocistos totales en el grupo cuya capacitación y fecundación había tenido lugar en presencia de ESS, tanto al 10 % como 2 %. Además, el uso del medio de coincubación suplementado con un 10 % de ESS generó blastocistos que mostraban una regulación al alza (P < 0,05) en la expresión de genes relacionados con la apoptosis, influenciando de esta manera el balance apoptótico de las células que componen el embrión preimplantatorio en la especie ovina. Todo ello nos permite afirmar que la variación de las distintas condiciones durante la PIV aquí descritas influye de forma distinta en ambas especies de pequeños rumiantes. Además, aunque dichas variables no reflejen diferencias cuantitativas en cuanto a producción de embriones en la mayoría de casos, estas sí son patentes a nivel molecular y, por lo tanto, deberían tenerse en cuenta a la hora de generar embriones de la mejor calidad posible.