Real-time visualization of phosphatidic acid in live cells using novel sensors based on fret

Resumen

Español: Este proyecto de tesis se ha centrado en el desarrollo de indicadores fluorescentes capaces de detectar cambios en los niveles de ácido fosfatídico (PA) en células vivas. El PA es el diacilglicerofosfolípido de estructura más sencilla y existe en las membranas celulares de todos los organismos vivos. Está en el centro de las rutas metabólicas de lípidos estructurales, de señalización y de almacenamiento de energía. Además, es un lípido estructural y un segundo mensajero. Su pequeño tamaño en forma de cono proporciona flexibilidad y una curvatura negativa a las bicapas lipídicas, y sus funciones de señalización vienen determinadas por su grupo fosfomonoéster, que distingue el PA de otros mediadores lipídicos y que proporciona un ambiente especial para el anclaje de las proteínas de unión a PA. Este fosfolípido ha atraído considerable atención debido a su papel como mediador lipídico y al gran número de efectores, que incluyen proteínas implicadas en la reorganización del citoesqueleto, el tráfico de vesículas, el crecimiento celular, la migración, la proliferación y la supervivencia celular. Tradicionalmente, los niveles de PA se han medido con cromatografía de capa fina y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Los recientes avances en esta última técnica han permitido la caracterización detallada del contenido y la composición de las cadenas acilo de PA en células y tejidos, pero a costa de perder su distribución espacial intracelular. Para revelar la producción de PA en los niveles celular y subcelular, se han descrito indicadores fluorescentes basados en dominios de unión a PA etiquetados con GFP. Estas quimeras se translocan a la membrana plasmática ante la producción de PA y proporcionan suficiente especificidad. Sin embargo, dichas sondas a menudo sólo proporcionan una información cualitativa y no permiten obtener imágenes de cambios de PA en subdominios particulares de las membranas u orgánulos. Para superar estas limitaciones, hemos construido biosensores genéticamente codificados, basados en transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). Hemos desarrollado construcciones utilizando los dominios de unión a PA de dos proteínas de unión a PA, neurogranina y Spo20, en combinación con las proteínas fluorescentes ECFP y variantes de Venus. En las quimeras sensibles a PA, hemos encontrado una relación inversa entre los niveles de PA y la eficiencia de FRET del sensor. La quimera con el mayor cambio de FRET se modificó para su expresión en la membrana plasmática y membrana mitocondrial externa, y así ser capaces de detectar fluctuaciones de los niveles de PA en células de mamífero in vivo. Los estudios llevados a cabo con el sensor dirigido a la membrana plasmática han mostrado variabilidad en los niveles basales de PA y en la actividad de la fosfolipasa D entre diferentes tipos celulares. Además, estímulos que activan las fosfatasas de PA, reduciendo los niveles de éste, estimularon la formación de lamelipodios y filopodios. Se observaron niveles más bajos de PA en el borde anterior que en el borde posterior de células HeLa en migración. En líneas celulares derivadas de células de Schwann y oligodendrocitos, los procesos de membrana implicados en la mielinización presentaron niveles de PA más bajos que en el cuerpo de la célula. El sensor dirigido a la membrana mitocondrial externa ha permitido la medición de fluctuaciones de PA por primera vez en esta membrana. Estos resultados sugieren que las actividades de fosfolipasa D y diacilglicerol quinasa contribuyen a los niveles de PA de esta membrana. Por último, la privación de suero disminuyó los niveles de PA en células HeLa, tanto en la membrana mitocondrial externa como en la membrana plasmática. En resumen, las sondas basadas en FRET para la detección de PA descritas han permitido obtener imágenes de la dinámica espacio-temporal del PA en la membrana plasmática y en la membrana mitocondrial externa. Las sondas han respondido a aumentos y disminuciones de PA y presentan un amplio rango dinámico. Además, hemos hallado fluctuaciones de PA durante la migración celular, la mitosis, los procesos de extensión de membrana, o durante la privación de suero. Estos nuevos biosensores, y versiones modificadas dirigidas a otras membranas, serán herramientas valiosas para ampliar nuestro conocimiento del papel del PA en la señalización intracelular y para estudiar la heterogeneidad subcelular de la formación de PA in situ.