Parámetros moleculares de competencia ovocitaria en las células del cúmulo humanas y bovinas

Abstract

La generación de embriones in vitro a partir de ovocitos permite distintas aplicaciones en ganadería y medicina humana. En ambos casos, su limitación principal es la baja eficiencia en términos de desarrollo a blastocisto y éxito de la gestación. La selección morfológica de embriones constituye la principal vía para la mejora de las tasas de gestación, pero distintos análisis moleculares podrían mejorar su valor predictivo. En esta tesis, hemos llevado a cabo análisis moleculares no invasivos en las células del cúmulo para identificar posibles marcadores de la competencia del ovocito. Estos análisis se han llevado a cabo en muestras de células del cúmulo bovinas y humanas agrupadas en función de la capacidad para el desarrollo de su ovocito correspondiente. En la especie bovina se establecieron tres grupos en función de su capacidad para el desarrollo 1) ovocitos que no dan lugar a embriones divididos (Cl-), 2) ovocitos que generan embriones que se dividen, pero no se desarrollan hasta blastocisto (Bl-) y 3) ovocitos que generan embriones capaces de desarrollarse a blastocisto (Bl+). En la especie humana, se establecieron otros tres grupos: 1) ovocitos que no dan lugar a blastocistos (Bl-), 2) ovocitos que dan lugar a blastocistos, pero no a gestaciones tras la transferencia (P-) y 3) ovocitos que generan embriones capaces de establecer embarazo (P+). Un primer experimento evaluó la cantidad relativa de ADN mitocondrial (ADNmt) en células del cúmulo humanas y bovinas, observando que este parámetro no estaba relacionado con la competencia del ovocito en ambas especies ni con distintos parámetros individuales como la edad, índice de masa corporal o consumo de tabaco en el caso de muestras humanas. Tampoco se observó una correlación entre la cantidad de ADNmt de las células del cúmulo y la del ovocito correspondiente en muestras bovinas. Otros experimentos realizaron análisis transcriptómicos en células del cúmulo bovinas y humanas. En el caso de la especie bovina se identificaron 19335 genes expresados de los cuales únicamente 49, 50 y 18 mostraron diferencias estadísticamente significativas (valor p ajustado < 0,05 y cambio de expresión > 1,5 veces) en las comparativas Bl+ vs. Bl-, Bl+ vs. Cl- y Bl- vs. Cl-, respectivamente. Diez genes mostraron diferencias significativas en ambas comparativas entre el grupo Bl+ vs. Bl- o Cl-: GSTA1, PSMB8, FMOD, SFRP4, HBE1, ITGA1, PAPPA, AKAP12, ITGA5 y SLC1A4. Estos genes están implicados en funciones como la adhesión celular mediada por integrinas, la disponibilidad de oxígeno, la señalización IGF y Wnt y la actividad de proteína kinasa A, y sugieren un mayor desarrollo folicular de los ovocitos más competentes. En el análisis de muestras humanas, se identificaron 17469 genes expresados, de los cuales únicamente 10, 11 y 5 mostraron diferencias estadísticamente significativas (valor p ajustado < 0,05 y cambio de expresión > 1,5 veces) en las comparativas P+ vs. P-, P+ vs. Bl- y P- vs. Bl-, respectivamente. CHAC1 mostró una abundancia mayor en los grupos capaces de alcanzar el estadio de blastocisto (P+ y P- vs. Bl-), mientras que CENPE, CD93, PECAM1 y HSPA1B mostraron el patrón opuesto. Únicamente EPN3 se relacionó con competencia para establecimiento de gestación, siendo menos abundante en el grupo P+ comparado con los grupos P-o Bl-. Un último experimento realizó un estudio metabolómico en células del cúmulo humanas, cuantificando 98 compuestos de los cuales 5 mostraron diferencias entre grupos: la asparragina, la prolina y el malonato fueron menos abundantes en el grupo P- comparado con Bl-, el malonato y la 5-oxiprolina fueron más abundantes el grupo P+ comparado con el P-, y el eritronato fue más abundante en el grupo P+ comparado con el Bl-. Además, se identificaron dos compuestos inesperados: el neurotransmisor N-acetil-aspartil-glutamato (NAG) y el pseudodipéptido ß-citrilglutamato, que pueden ejercer funciones de señalización y remodelación de la cromatina, respectivamente.