Optimization of vitrification protocols for embryos and oocytes in the porcine species

Abstract

Objetivos: el objetivo principal de esta Tesis fue optimizar el protocolo de vitrificación de embriones porcinos mediante la modificación del sistema Cryotop (Cryotopm) para la vitrificación simultánea de un elevado número de embriones y ovocitos, y analizar su impacto en el transcriptoma embrionario. Para este fin, los objetivos específicos contenidos en esta Tesis fueron: 1) evaluar el sistema Cryotopm en su forma abierta y cerrada para la vitrificación de mórulas y blastocistos producidos in vivo, y su calidad tras el calentamiento; 2) investigar los efectos de la vitrificación simultánea de un elevado número de blastocistos sobre la expresión génica y el transcriptoma de microARNs (miARNs); 3) evaluar la viabilidad de blastocistos producidos in vitro tras la vitrificación con el sistema Cryotopm; 4) estudiar el impacto del tiempo de equilibrado con crioprotectores y la suplementación con melatonina en el medio de maduración in vitro en la viabilidad y calidad de los ovocitos vitrificados y calentados con el sistema Cryotopm. Metodología: En la metodología general incluida en esta Tesis se describen los procesos de obtención de embriones in vivo y de producción de embriones in vitro, la vitrificación y el calentamiento (V-C) de embriones y ovocitos y la evaluación de la viabilidad tras la V-C. La metodología específica del Artículo 1 describe técnicas de evaluación de la calidad de los embriones V-C. En la metodología de los Artículos 2 y 3 se describen los procesos de extracción de ARN de los blastocistos y preparación de las muestras para los estudios de expresión génica y de transcriptoma de miARNs, respectivamente. La metodología del Artículo 4 incluye la evaluación de la calidad de los embriones producidos in vitro tras la V-C. Por último, la metodología específica del Artículo 5 describe las técnicas empleadas para la evaluación de la viabilidad y la calidad de los ovocitos tras la V-C. En cada artículo se incluyen además los análisis estadísticos realizados, así como un breve diseño experimental. Conclusiones: Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral son: 1) El sistema Cryotopm abierto (CA) permite la vitrificación de 20 embriones porcinos obtenidos in vivo en los estadios de mórula, blastocisto temprano y blastocisto, proporcionando unos parámetros de viabilidad y calidad post-calentamiento similares a la de los embriones frescos; 2) La vitrificación con los sistemas CA y SOPS tiene un efecto moderado sobre la expresión génica de los blastocistos porcinos. En embriones vitrificados con el sistema CA, se modifica la expresión de más genes relacionados con la proliferación celular y se alteran menos genes relacionados con la apoptosis;3) La vitrificación con los sistemas CA y SOPS modifica la expresión de miARNs en los blastocistos porcinos, habiendo mínimas diferencias entre ambos sistemas, alterando la expresión de miARNs relacionados con la proliferación celular, la apoptosis y la respuesta celular al estrés; 4) La vitrificación simultánea de 20 blastocistos porcinos producidos in vitro con el sistema CA proporciona mejores resultados de viabilidad y parámetros de apoptosis que la vitrificación empleando el sistema SOPS; 5) La viabilidad de los ovocitos maduros de cerdo vitrificados con el sistema CA aumenta con el incremento del tiempo de equilibrado con los crioprotectores, alcanzando su máximo a los 60 minutos y presentando estos ovocitos una morfología de la placa metafásica similar a la de los ovocitos sin vitrificar; 6) La suplementación con 10-9 M de melatonina en el medio de maduración no tiene efecto en la viabilidad ni la morfología de la placa metafásica de los ovocitos maduros de cerdo vitrificados con el sistema CA.