Neutrophils and macrophages contribution to the hyperinflammation induced by SARS-CoV-2 spike protein and Salmonella Typhimurium infection in zebrafish

Abstract

Esta tesis doctoral estudia el papel de los neutrófilos y macrófagos en la inflamación inducida por la proteína Spike (S) del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2) y la infección por Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST), utilizando el pez cebra como modelo, con un enfoque en la actividad del inflamasoma. El SARS-CoV-2 causa neumonía viral en humanos, conocida como enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). La proteína S del virus se une al receptor ACE2 en las células epiteliales humanas, lo que conduce a una disminución de ACE2, provocando vasoconstricción, estrés oxidativo e inflamación. Además, la proteína S contribuye al síndrome de liberación de citoquinas (CRS) asociado a COVID-19 y activa el inflamasoma NLRP3, una plataforma molecular involucrada en la eliminación de infecciones intracelulares y en la respuesta a daños estériles. Con respecto a ST, esta bacteria intracelular es un patógeno relevante que causa enfermedades transmitidas por alimentos y es un modelo excelente para estudiar las respuestas del huésped a bacterias intracelulares. Los neutrófilos y macrófagos, como primeros en responder a la infección, interactúan para regular la inflamación. Los neutrófilos suelen llegar primero y desencadenar que los macrófagos adopten un fenotipo proinflamatorio (M1), aunque los macrófagos antiinflamatorios (M2) persisten y strán implicados en la resolución de la inflamación. Aunque la interacción entre estos dos tipos de células es ampliamente reconocida, el papel desempeñado por sus inflamasomas en estas interacciones no lo es. Esta tesis doctoral utilizó la inyección de larvas de pez cebra con el dominio S1WT de la proteína S del COVID-19 para inducir inflamación, revelando un aumento de macrófagos M1 sin cambios significativos en los neutrófilos. La eliminación de neutrófilos redujo la inflamación y la monocitosis, mientras que la eliminación de macrófagos tuvo el efecto opuesto, destacando sus diferentes funciones. Experimentos adicionales mostraron que la inhibición del inflamasoma en neutrófilos atenuó la inflamación y la neutrofilia en modelos de pez cebra asociados con CRS por COVID-19 e infección por ST, mientras que la inhibición del inflamasoma en macrófagos aumentó la inflamación y la monocitosis en ambos modelos. Estos resultados demuestran que el inflamasoma de neutrófilos es proinflamatorio, mientras que el inflamasoma de macrófagos desempeña un papel antiinflamatorio no apreciado previamente, al menos en los modelos de CRS asociado a COVID-19 e infección por ST. Además, la sobreactivación del inflamasoma en neutrófilos aumentó la resistencia bacteriana y redujo la inflamación, y produjo monocitosis y neutropenia debido a la muerte de neutrófilos mediante piroptosis mediada por gasdermina E (Gsdme). Esta sobreactivación también resultó en un aumento en el número de macrófagos, que, inesperadamente, eran más resistentes a la eliminación por la bacteria. En contraste, la inhibición del inflamasoma de macrófagos mediante la expresión específica de DN Asc no protegió a estas células de la eliminación bacteriana. Sin embargo, la sobreactivación del inflamasoma de macrófagos disminuyó la resistencia bacteriana y exacerbó la inflamación y el reclutamiento de neutrófilos, y produjo neutrofilia y monocitopenia en el modelo de infección por ST. Se generó una nueva línea transgénica, Tg(lyz:Dendra-Asc), para visualizar la proteína ASC in vivo. Los neutrófilos que expresaban Dendra-Asc mostraron dos fenotipos diferentes: distribución uniforme de ASC dentro de la célula y células con aglomerado de ASC ya formado, lo que indica que la sobreactivación de ASC por sí sola puede iniciar la formación de ASC y la activación del inflamasoma sin estímulos adicionales. Un hallazgo significativo fue la transferencia de ASC de neutrófilos a macrófagos, indicando un interacción directa entre estas células. Además, la inflamación impulsada por la proteína S aumentó el número de neutrófilos activados con un aglomerado ASC, y promovió su liberación y transferencia a neutrófilos y macrófagos circundantes. También se examinó el papel de Gsdme, la molécula efectora clave en la piroptosis. La deficiencia de Gsdme y la administración de glicina, que inhibe la rotura de la membrana plasmática, rescataron la muerte de neutrófilos causada por la sobreactivación del inflamasoma, pero inesperadamente redujeron la monocitosis, revelando la compleja interacción entre estas células y las propiedades antiinflamatorias dependientes de Gsdme del inflamasoma de macrófagos. Para explorar más a fondo la interacción entre neutrófilos y macrófagos, se utilizó el modelo de CRS asociado con COVID-19 para investigar el papel de la quimiocina Cxcl8 y sus receptores Cxcr1 y Cxcr2. Los neutrófilos fueron los primeros en llegar al sitio de inflamación, guiados por Cxcl8, que se unió a los receptores Cxcr1 y Cxcr2. Estos hallazgos sugieren que el rápido reclutamiento de neutrófilos hacia la proteína S fue esencial para montar una respuesta inflamatoria adecuada y para el reclutamiento y activación subsecuente de macrófagos. Además, la inhibición farmacológica de Cxcr2 afectó mínimamente la inflamación local, pero redujo significativamente la inflamación sistémica y la mielopoyesis de emergencia. La disminución de Cxcr2 mediada por CRISPR/Cas9 confirmó su papel en el reclutamiento de células inmunitarias y la inflamación. Además, Cxcr1 también desempeñó un papel en la interacción entre neutrófilos y macrófagos, ya que la deficiencia de Cxcr1 aumentó el reclutamiento de neutrófilos y la neutrofilia, mientras que afectó negativamente el reclutamiento y expansión de macrófagos, sugiriendo su papel en la resolución de la inflamación. En general, este estudio demuestra una interacción entre neutrófilos y macrófagos mediada por el inflamasoma, con implicaciones para comprender y potencialmente tratar enfermedades inflamatorias.